فایل ورد کامل مقاله اصلاح سنتی نباتات با دستکاری ژنتیکی؛ تحلیل تاریخی و علمی روش‌های سنتی در بهبود عملکرد گیاهان

توجه : به همراه فایل word این محصول فایل پاورپوینت (PowerPoint) و اسلاید های آن به صورت هدیه ارائه خواهد شد

 فایل ورد کامل مقاله اصلاح سنتی نباتات با دستکاری ژنتیکی؛ تحلیل تاریخی و علمی روش‌های سنتی در بهبود عملکرد گیاهان دارای ۱۷۱ صفحه می باشد و دارای تنظیمات در microsoft word می باشد و آماده پرینت یا چاپ است

فایل ورد فایل ورد کامل مقاله اصلاح سنتی نباتات با دستکاری ژنتیکی؛ تحلیل تاریخی و علمی روش‌های سنتی در بهبود عملکرد گیاهان  کاملا فرمت بندی و تنظیم شده در استاندارد دانشگاه  و مراکز دولتی می باشد.

توجه : در صورت  مشاهده  بهم ریختگی احتمالی در متون زیر ،دلیل ان کپی کردن این مطالب از داخل فایل ورد می باشد و در فایل اصلی فایل ورد کامل مقاله اصلاح سنتی نباتات با دستکاری ژنتیکی؛ تحلیل تاریخی و علمی روش‌های سنتی در بهبود عملکرد گیاهان،به هیچ وجه بهم ریختگی وجود ندارد

---

بخشی از متن فایل ورد کامل مقاله اصلاح سنتی نباتات با دستکاری ژنتیکی؛ تحلیل تاریخی و علمی روش‌های سنتی در بهبود عملکرد گیاهان :

روش های سنتی اصلاح نباتات مبتنی بر دستکاری ساختار ژنتیکی

فصل اول

مقدمه و کلیات

فصل اول
مقدمه:
روشهای سنتی اصلاح نباتات مبتنی بر دستکاری ساختار ژنتیکی گیاه کامل و از طریق تولید جنسی است. در سالهای اخیر روشی برای دستکاری ژنتیکی در سطح سلولی پیدا شده است که روشهای اصلاحی را بطور منحصر بفرد کامل می کند. موجودیت پیدا کردن روشهای کشت بافت و سلول را می توان به پیشرفتهای ناشی از دانش کشت سلولی و زیست شناسی مولکولی دانست (۴ و ۵۱)

بیوتکنولوژی یا فناوری زیستی مجموعه ای از فنون را تشکیل می دهد که امکان بکارگیری، توانایی و کارآیی سلولهای موجودات زنده اعم از حیوانی یا گیاهی را فراهم می سازد. در سالهای اخیر با انجام تحقیقات متعدد در حوزه بیوتکنولوژی کشاورزی این بخش دارای جایگاه مهم و باارزشی شده است و این امکان را در رابطه با گیاهان زراعی فراهم نموده است که بسیار مطالب کارآتر از روشهای کلاسیک اصلاح نباتات با استفاده از تکنیکهای مختلف از قبیل دست ورزی ژنتیکی (Genetic manipulation)، کشت بافت و سلول گیاهی در شرایط In Vitro و غیره، گیاهانی با سازگاری متناسب تر و بیشتر به شرایط محیطی و همچنین سازگار با نیاز انسانها تولید نماید.

تکنیک کشت بافت و سلول گیاهی در شرایط In Vitro ازجمله فنون بیوتکنولوژی است که کاربرد آن به اوایل سالهای ۱۹۵۰ می رسد. بر اساس این تکنیک، سلول گیاهی یا بافت از اندامهایی مثل ریشه، ساقه، برگ و گل آذین یا هر اندام دیگری از گیاه جدا شده و در شرایط کاملاً استریل و گندزدایی شده، در درون لوله های آزمایش محتوی محیط غذایی مصنوعی قرار گرفته و با تأمین نیازهای نوری و حرارتی مناسب تبدیل به یک گیاه کامل می گردد. این تکنیک همانطور که اشاره شد امکان تولید هزاران گیاهچه مشابه گیاه مادری را در مدت زمان بسیار کوتاهی و در فضای فیزیکی بسیار محدودی فراهم می‌سازد که با انتقال این گیاهچه ها به سطح گلخانه و مزرعه تولید

انبوهی از گیاهان مورد نظر را می توان باعث شد. در اصلاح نباتات با استفاده از تکنیک کشت بافت و نیز تولید کالوس یا گیاهچه ها در مقیاس وسیع و انجام گزینش در بین نمونه ها می توان از ارقام مقاوم به استرسهای محیطی را تولید نمود. فنون فوق فرصتهای مناسبی در بخشهای مختلف تحقیقاتی، اقتصادی بوجود آورده است که با تقویت بخش دولتی و فعال نمودن بخش خصوصی کارایی این بخشها را برای تأمین و تولید محصولات اساسی کشور را، بطور قابل ملاحظه ای می توان افزایش داد. (۵۱ و ۹۸)

تاریخچه اهمیت کشت بافت:
مفهوم کشت بافت گیاهی خلاصه عبارت کشت پروتوپلاست گیاهی، سلول گیاهی، بافت و کشت اندام گیاهی است. کشت بافت و سلول گیاهی بر اساس نظریه شوان مبنی بر دارا بودن خاصیت توتی پوتنسی سلولها پایه گذاری شد. توتی پوتنسی خاصیتی است که بر اساس آن یک سلول دارای توان تبدیل شدن به موجود کامل است. در سالهای اخیر، تکنیک کشت بافت گیاهی به یک ابزار بسیار قدرتمند برای تکثیر و اصلاح بسیاری از گونه های گیاهی تبدیل گشته است. این تکنیک با ابراز نظریه گوتلیب هابرلاندت در مورد خاصیت توتی‌پوتنسی در سلول گیاهی در آغاز قرن بیستم آغاز گردید. هارلاند پیشنهاد نمود که روشهای جداسازی و کشت اندام گیاهی باید توسعه

یابد و ادعا نمود که اگر محیط و مواد غذایی سلولهای کشت شده، دستورزی شده باشند، آن سلولها باید صفات ارثی مربوط به مراحل رشد و نموی گیاه اولیه را تکرار نمایمد. دیدگاه هابرلاند در حقیقت قابل توجه بود زیرا وی حتی بیان داشت که خارج از سلولهای سوماتیکی زنده، جنینهای مصنوعی به صورت غیر جنسی رشد و نمو می یابند.(۵) احتمالاً وایت نخستین کسی بود در سال ۱۹۵۴ مسئله کشت سلولی را به روشنی بیان کرد. او بیان داشت که تفاوتهای بین سلولهای دیگر در آن ارگانیسم می باشد. لذا امکان دارد بتوان با جدا نمودن سلول، پتانسیل نهفته توتی پوتنت را به آنها بازگردانید. البته احتمال دارد که این خاصیت در سلول برای همیشه از دست رفته باشد. اسکوگ و میلر در ۱۹۵۷ پیشنهاد نمودند که اثرات متقابل کمی بین اکسین و سیتوکینین نوع رشد و مراحل مورفولوژیک را که باید در گیاه رخ دهد، تعیین می کنند. مطالعات آنها در توتون نشان داد که نسبت بالای اکسین به سیتوکسین باعث القای رشد ریشه می شود؛ درحالیکه نسبت بالای سیتوکسین به اکسین باعث القای رشد ساقه میگردد، هرچند که این الگو پاسخ کلی و عمومی نیست. (۱ و ۵ و ۹ و ۹۸)

دستورزی نسبت اکسین به سیتوکینین در بسیاری از گونه ها و جنسها برای ریخت زایی موفقیت آمیز بوده است. کارهایی که توسط مورل (۱۹۶۰) روی ازدیاد ارکیده انجام گردیده است، آغازی برای کاربرد تکنیک کشت بافت گیاهی برای تکثیر و اصلاح بسیاری از گونه های گیاهی بود که منجر به توسعه و گسترش استفاده از محیطهای کشت جدید با غلظتهای بالای نمک توسط موراشیگ و اسکوک گردید.
در سال ۱۹۶۶ نیز گوها و محشوری امکان ایجاد تعداد زیادی از گیاهچه هاپلوئید از دانه داتوره بوسیله کشت بساکهای نابالغ را ثابت کردند. (۹۸)
در سال ۱۹۷۰ اولین امتزاج موفقیت امیز پروتوپلاست در محیط کشت تحقق یافت. در همین سال انتخاب موتانهای بیوشیمیایی در شرایط آزمایشگاهی صورت گرفت. در ۱۹۷۴ تولید گیاهان هیبرید حاصل از امتزاج پروتوپلاستهای هاپلوئید به نتیجه رسید. (۱ و ۹۸)
تحقیقات در زمینه کشت بافت گیاهی از سال ۱۹۷۵ به بعد بطور چشمگیری افزایش یافت و از دهه ۱۹۸۰ به بعد به عنوان بخش مهمی از بیوتکنولوژی گیاهی مورد توجه بسیاری از دانشمندان قرار گرفته است بطوریکه در سال ۱۹۷۷ توسط چلتون و همکاران ادغام موفقیت آمیز DNA پلاسمید Ti از Agrobacteriam tumefaciens به گیاهان صورت گرفت. (۹۸ و ۱۰۰)

در حال حاضر کشت بافت به عنوان پیش نیاز مهندسی ژنتیک از اهمیت ویژه ای برخوردار است. از طرفی کشت بافت بعنوان مکمل روشهای کلاسیک متداول در اصلاح نباتات بکار می رود نه جایگزین آن (۸۶ و ۱۰۰)

اساس گیاه شناسی برای کشت بافت:
ظرفیت طبیعی گیاهان به منظور تکثیر توسط فرآیندهای غیرجنسی، اساس تکثیر در تکنیک کشت بافت است. کشت بافت به سادگی به ما کمک می کند تا از پتانسیل طبیعی موجود در گیاه برای رشد و تکثیر استفاده کنیم که البته تکنیکی بسیار کارآمد و قابل پیش بینی است (۶۲ و ۹۶)

اهداف مورد نیاز با استفاده از تکنولوژیهای جدید کشت بافت و مهندسی ژنتیک:
• تکثیر سریع گیاهان جهت استفاده در تحقیقات اصلاحی ژنتیکی.
• تولید گیاهان هاپلوئید و دای هاپلوئید
• ایجاد هیبریداسیون سوماتیکی بین گونه ای و بین جنسی
• ایجاد موتاسیونهای القایی

• حفظ و نگهداری منابع گیاهی از طریق کشت بافت
• انتقال ژنهای خارجی مطلوب به سلولهای مورد نیاز از طریق کشت بافت و مهندسی ژنتیک
• تولید گیاهان عاری از ویروس
• ایجاد لاینهای مقاوم به امراض و بیماریها
• ایجاد لاینهای مقاوم به شوری و خشکی
• تهیه لاینهای مقاوم به علف کشها

فصل دوم

خصوصیات زراعی

فصل دوم
تاریخچه:
طبق نظر واویلوف دانشمند روسی، مبدأ یونجه مرکز خاور نزدیک آسیای صغیر، قفقاز ایران و مناطق کوهستان روسیه است. مرکز جغرافیائی یونجه را غالباً کشور ایران می دانند. باید گفت که یونجه مدتها پیش از زمانی که از آن در تاریخ ذکری به میان آمده است، کشت می شد و هم اکنون نیز بطور وحشی در اکثر نقاط دنیا رشد می یابد. مطالعات خانم سینکایا (sinskaya) نشان می دهد که یونجه از لحاظ مبدأ دارای دو مرکز است. نخستین مرکز آن ناحیه کوهستانی قفقاز بود که ارقام جدید یونجه های اروپائی از آن بدست آمده است. دومین مرکز مستقل پیدایش را آسیای مرکزی می دانند.

تاریخچه یونجه، سرگذشت مهمترین گیاه علوفه ای دنیا و اولین گیاه علوفه ای اهلی شده است که بشر اولیه اهمیت و ارزش آن را بعنوان غذای دام تشخیص داده است. از نظر تکاملی، توجه به کشت یونجه بطور چشمگیری موفقیت آمیز بوده است که علت این امر شاید وجود سیستم ریشه ای مناسب آن است که طی قرون متمادی و تکامل همزیستی باکتری ریزوبیوم و ریشه یونجه، گیاه یونجه به یک منبع ازت سرشاری دست یافته است که نیاز این گیاه به این عنصر غذایی را مرتفع می نماید. از طرفی ریشه یونجه بعلت عمیق و راست بودن، توانایی کافی در جذب رطوبت از اعماق خاک را داراست که گیاه را در شرایط خشکی از خطر نجات می دهد. همچنین گیاه یونجه در اثر خشکی و سرما به حالت رکود و خواب رفته و بعد از وجود شرایط مناسب به رشد خود ادامه خواهد داد. ساقه های خزنده یونجه (stolon) و ریشه های خزنده زیرزمینی (Rizom) و طوقه به خاک نشسته یونجه مقاومت گیاه را در مقابل سرما و یخبندان افزایش می دهد. (۶ و ۶۲)

اهمیت اقتصادی:
غذای دامهای نشخوار کننده، سیستم پیچیده ای را در دنیا از تظر تولید غذائی به نمایش می‌گذارد. ۷۵ درصد غذای تولید شده دنیا را حیوانات نشخوارکننده مصرف می کنند.

۸۰-۶۰ درصد غذای حیوانات نشخوارکننده را علوفه تامین می نماید. ۱۸ درصد غذای بشر و ۳۶ درصد از پروتئین مصرفی انسان را علوفه تامین می کنند و از این لحاظ بهترین وسیله برای تقویت غذائی بشر می باشد. یونجه گیاهی است که بیشترین تولید در میان علوفه ها را در دنیا به خود اختصاص داده است. در دنیا یونجه بعنوان غذای دام بطور مستقیم بصورت چراگاه و یا در دامداریهای صنعتی مورد استفاده قرار می گیرد و بعنوان منبع هیدرات کربن و پروتئین دام مورد استفاده قرار می گیرد.
کشور ایران دارای ۲۰ میلیون هکتار زمین قابل کشت است که سالیانه حدود ۱۰ میلیون هکتار به حال آیش گذاشته می شود و حدود ۵/۸ تا ۹ میلیون هکتار به زیر کشت می رود. ۶/۵ میلیون هکتار به کشت گندم و بقیه به سایر محصولات شتوی و صیفی اختصاص دارد که ۲۸۴۹۳۶ هکتار آن را یونجه تشکیل می دهد. (۶ و ۶۴)

گیاهشناسی یونجه:
گیاهی است چند ساله دارای ریشه ای راست و مستقیم که به نام ریشه اولیه یونجه معروف است. این ریشه بعد از قرار گرفتن بذر در خاک و جذب رطوبت، بدون انشعاب است. به موازات تشکیل این ریشه قسمت زیر لپه یا هیپوکوتیل در زیر سطح خاک نمودار می شود. و با طویل شدن آن باعث جوانه زدن و خارج شدن از سطح خاک می شود که در این مرحله گیاهی است حساس نسبت به کمبود آب، افزایش بیش از حد آب، شوری خاک و سله بستن. وقتی زیر لپه یونجه از سطح حاک نمودار گردد، در این موقع یونجه جوانه زده فقط دارای دو لپه یا کوتیلدون است که بصورت برگهای متورم به نظر می آیند و بعد از مدتی از بین رفته و برگهای اصلی از مرکز آن بوجود می آیند که دارای دمبرگی طول می باشند که معمولاً قلبی شکل بوده و شباهتی به برگهای اصلی یونجه ندارد. که بعد از طی زمان نخستین برگ مرکب ۳ برگچه ای نمایان می شود.

علاوه بر ریشه اصلی، ریشه های جانبی نیز از سلولهای حاشیه استوانه مرکزی ریشه اصلی نمودار می شود. که عامل موفقیت یونجه در مقابل عوامل نامساعد وجود سیستم مناسب ریشه می باشد. بعد از کشت چند هفته از رشد و نمو گیاه و وجود رابطه همزیستی ریشه گیاه با باکتریهای ریزوبیوم یونجه دیگری نیازی به ازت خاک ندارد. علاوه بر آن ریشه عمیق و راست یونجه موجب حذب رطوبت از اعماق تا ۵ متر نیز می شود. که امتیاز باارزشی در مقاومت به خشکی است. ساقه های خزنده روی زمین (استولون)، ریشه های خزنده زیرزمینی (ریزوم) از قسمتهایی هستند که در طول مدت رشد و نمو این گیاه به وجود می آیند.

ساقه اصلی یونجه چهارگوش به نظر می رسد و مغز آن از سلول های پارانشیمی نسبتاً بلند و فشرده پر شده است و دارای انشعابات بسیار زیاد و ظریفی است که هر کدام برگهای مرکب زیاد دارد. ساقه یونجه در نزدیک سطح خاک، انشعابات زیادی تولید کرده که به مرور زمان چوبی و ضخیم می‌شود و به طوقه تبدیل می گردد. که از این محل ساقه های کوتاه منشعب و ضخیم بوجود می آید که تبدیل به ساقه های بلند و اصلی یونجه می شود. تعداد ساقه ها بین ۵ تا ۴۰ عدد است که از ناحیه طوقه خارج می شود و از هر ساقه بعد از چیدن یا رسیدن، ساقه دیگری تولید می شود. بعد از گذشت چند سال طوقه بصورت توده انبوهی درمی آید که در داخل خاک و یا خارج از خاک قرار می گیرد. ساقه های هوائی راست، سبزرنگ و پوشیده از کرک های نرم است. ارتفاع این ساقه ها در ارقام مختلف، در برداشت های مختلف، در مناطق گوناگون و در خاکها، با یکدیگر متفاوت است.

برگ های یونجه مرکب، رنگ برگچه های یونجه سبز تیره، تخم مرغی، سطح زیرینشان پوشیده از کرک است. برگچه و سطح برگ مرکب یک دمبرگچه کوتاه دارد ولی برگچه های جانبی فاقد دمبرگچه می باشند. در قاعده دمبرگ دو گوشوارک یا استیپول وجود دارد که به دمبرگ متصل هستند، هر کدام زائده ای باریک و بلند در انتها و نیز دندانه هائی ظریف و کوچک در قاعده دارد. برگچه های یونجه کشیده، طویل و تقریباً در انتهای آن مضرس است. برگچه ها دارای یک رگبرگ اصلی یا رگبرگچه هستند که تا راس برگچه امتداد می یابد و از این رگبرگچه اصلی، رگبرگچه های فرعی منشعب می شود.

گل یونجه دارای خصوصیات ویژه ای است. رشد و نمو گل یونجه، از انتهای شاخه ها با تغییر حالت از رشد و نمو رویشی به زایشی آغاز می شود. این تغییر حالت در فصل بهار از دهمین تا چهاردهمین گره از طوقه یونجه و در فصا تابستان از ششمین تا دهمین گره صورت می گیرد. بنابراین مفهوم آن این است که یونجه هایی که در بهار به گل می نشینند دارای رشد و نمو زیادتری هستند و ارتفاع ساقه آنها هم بیشتر است ولی یونجه هائی که در تابستان به گل می نشیند ارتفاع کمتری دارند. هر گل دارای یک کاسه، یک جام، ده پرچم و یک مادگی است. کاسه گل شامل پنج کاسبرگ متصل است که به پنج قسمت یا دندانه تقسیم می شود و طول هر قسمت تقریباً برابر طول

کاسه است. جام گل شامل ۵ گلبرگ به نامهای درفش، بال و ناو به هم پیوسته است. رنگ گل یونجه معمولی شبهی از رنگ ارغوانی یا بنفش است. رنگ گل یونجه داسی مدیکاگو فالکاتا، زرد تیره و رنگ یونجه مدیکاگو لوپولینا، زرد رنگ است. رنگ گل ارقام مختلف گونه های جنس میکاگوممکن است سفید، بنفش، زرد و یا رنگارنگ باشد. مادگی یونجه شامل یک برچه با تخمدان فوقانی، خامه صاف و میان تهی و کلاله مشخص است. تخمک ها بطور متناوب در طول شکاف شکمی تخمدان تشکیل می شوند. معمولاً ده تا دوازده تخمک در تخمدان یونجه رشد می کند، ولی تعدادشان ممکن است بین شش تا هیجده عدد تغییر کند. درون گل یونجه، ده پرچم قرار دارد که نه عدد آنها به هم متصل و دهمین پرچم، نزدیک به درفش آزاد است. میله های پرچم مادگی را احاطه می کنند. (۶)

آب و هوا:
گیاه یونجه بهترین رشد را در مناطقی دارد که هوای آن مناطق، خشک، آفتابی، گرم و نیز آب زیادی در دسترس داشته باشد. که در شرایط ایران جلگه خوزستان، دشت مغان و منطقه جیرفت مطلوب به نظر می رسد. بطور کلی در ایران می توان سه منطقه مختلف آب و هوائی را برای رشد و نمو یونجه در نظر گرفت: مناطق خشک، نیمه خشک و مرطوب. مستعدترین مناطق برای رشد و نمو یونجه، در صورت وجود آب کافی مناطق خشک و پس از آن مناطق نیمه خشک و در آخر مناطق مرطوب است.
یونجه در مقابل تغییرات دمای محیط حساس نیست و قادر است دمای ۵۰ تا ۶۰ درجه سانتیگراد زیر صفر و ۵۰ درجه سانتیگراد بالای صفر را تحمل نماید. یونجه با ریشه های عمیقی که دارد می تواند در مناطق نسبتاً خشک و کم آب مقاومت کند.

کشت یونجه در ارتفاعات مختلف انجام می گیرد. از ارتفاع ۲۴۶۵ متری در آبعلی ۱۶۴۴ متری در همدان تا ارتفاع ۱۰۰۰ متری در ابرقو کشت می شود. کشت یونجه در ارتفاع پایین تر مثل ابادان و اهواز (۱۳ متر) و حتی پایین تر از سطح دریای آزاد در رشت، امکان پذیر می باشد.
یونجه در محل های گوناگونی و در خاکهای مختلف رشد و نمو می یابد. در نیم کره شمالی تا نیم کره جنوبی از مناطق کوهستانی تا مناطق جلگه در خاکهای سنگین تر خاکهای سبک و شنی رشد می یابد.

بغیر از مرحله جوانه زدن در سایر مراحل رشد به شوری خاک مقاوم است. در خاکهای آهکی نیز یونجه رشد خوبی می تواند داشته باشد. (۶)

کاربرد بیوتکنولوژی در اصلاح یونجه:
چگونه بیوتکنولوژی باید برای توسعه یک برنامه پیشرفته اصلاحی یونجه بکار برده شود تا واریته های بهتر، متناسب برای تحویل در تولید مثل با حداکثر خاصیت هتروزیگوسیتی ایجاد شود، موضوعی است که اخیراً مورد توجه دانشمندان قرار گرفته است. در این مقوله، بهبود نژادهای والدینی و بکارگیری هیبریداسیون می تواند تغییر و تبدیل در واریته را در جهت اهداف مشخصی افزایش دهد. موارد زیر جزو بارزترین راهکارهای بیوتکنولوژی برای بهبود یونجه است (۶۴ و ۱۰۳ و ۱۰۴ و ۸۹)

مهندسی ژنتیک:
ژنهای بالقوه برای مهندسی ژنتیک عبارتند از: ژن پروتئینی
Bacillus thuringiensis برای کنترل حشرات بال پولکی، ژنهای پروتئینی پوشش ویروس، ژن مقاومت به علف کش، ژنهای بازدارنده آنزیم (تجزیه کننده) پروتئین برای بهبود کمیت و کیفیت و از بین بردن آنزیمهای هضم کننده پروتئینی قارچی و شکارچی حشرات (Abelson, 1989, Ryan, 1939)، ژنهای پروتئینی بازدارنده آنزیم (تجزیه کننده) پلی گالاکتوز برای جلوگیری از فعالیت endo-polygalacturonase میکرو ارگانیسم های از بین برنده دیواره سلولی (Degra et al 1988)، ژن glutamin-synthetose anti-sense برای افزایش محصول، ژنهای آنزیم کننده، کیتین برای هیدرولیز کردن جلد حشرات تغذیه کننده (Abelson , 1989) و مواردی از قبیل مقاومت به آلومینیوم. ورای

سهولت دسترسی، محدودیت عمده در ترکیب ژنهای مورد نظر به درون واریته های تجارتی همان پروسه ای خواهد بود که بوسیله آن واریته های یونجه اصلاح می شوند. واریته های یونجه با ترکیب تعداد زیادی افراد اصلاح شده و واریته ترکیبی را بوجود می آورند. این پروسه سهم ژنتیکی فرد را در جمع به حداقل می رساند.
(۱۰۳ و ۸۳)
هیبریداسیون گسترده:
تکنیکهای پروتوپلاسم و درآوردن جنین برای هیبریداسیون یونجه های زراعی گونه های یونجه یک ساله Medicago با لگومهای دیگر مثل اسپرس (Onobrychis vicifolia Scop) و شبدر (Lutus corniculatus L.) بکار می رود. یکی از برجسته ترین کارهای این شیوه انتقال مقاومت می باشد (مقاومت به نفخ). (۸۷ و ۹۲)

فصل سوم

کشت بافت

فصل سوم
بررسی منابع:

کشت بافت یونجه:

اولین گزارش مربوط به کشت بافت یونجه توسط ساندروز وبینگهام در سال ۱۹۷۲ انتشار یافت. آنها گزارش کردند که کالوس می تواند تخمدان نارس ، میان گرهها، هیپوکوتیل و حتی پرچم نارس تولید شود. همچنین همه گیاهان تولید شده دارای کروموزومهای سوماتیکی برابر گیاهان دهنده بودند. بعد از این تحقیق راندمان باززایی رو به پیشرفت گذاشت. آرسیونی و همکاران(۱۹۹۰) تعداد ی از گزارشات کشت بافت یونجه که شامل نوع گونه، کالتیوار، ریزیونجه، محیط کشت القاء کالوس و یا محیط کشت رشد ، محیط باززایی و نوع باززایی را گردآوری کردند. (۸)
در سال ۱۹۷۲ سانددرز و بینگهام تولید کالوس را در محیط نیمه جامد بررسی کردند. تحقیقات آنها نشان داد که اضافه کردن NAA، تیروزین یا سیتوکینین هرکدام به تنهایی یا به صورت ترکیب، کالوس زایی را افزایش می‌دهد. بهترین تولید که روی محیط بدست آمد شامل مواد غیرآلی و ویتامینها ازجمله ۱۰۰mg/l اینوزیتول و ۲gr/l عصاره مخمر بود. توانایی کالوسهای تازه برای باززایی بستگی به سطوح مختلف هورمونی داشت ولی طول مدت روز در تمایز اثری نشان نداد. از کشت بساکهای بالغ، قسمتهای میان گره، هیپوکوتیل، بذور و تخمک بالغ، کالوس و گیاه باززایی شده بدست آمد.
در واقع آزمایشات دقیق تأثیر هورمونها در سطح القاء کالوس اولین بار توسط دانشمندان فوق بررسی شد، آنها مشاهده کردند که وقتی ۲-۴-D در محیط آغازیدن وجود نداشت جوانه ای هم تشکیل نشد. بنابراین ۲-۴-D تنها هورمونی است که مسئول همراهی القاء کالوس و اندامزائیهای بعدی باشد. (۸۹ و ۸۴)
در سال ۱۹۸۷ وان و لیانگ تحقیقی در مورد اثرات کاینتین در کالوسهای یونجه انجام دادند:

محیطهای کالزایی B5، B2K، ۱۷۹۵۱ برای مطالعات اثرات کینتین مورد استفاده قرار گرفت و مورفولوژی، هیستولوژی و باززایی در یونجه ها بررسی شد. حضور کینتین در القاء کالوسهای ضروری تشخیص داده شد. کالوسهایی که توسط کینتین تولید شده بودند در محیط B5 و ۱۷۹۵۱ دارای سلولهای متراکم بودند که حاوی ناحیه مریستمی بودند و تمایز بالایی در گیاهچه های حاصل از محیط باززایی نشان دادند. اکثر کالوسهای تولید شده داراری سلولهای تخصصی و ساختمان قابل انعطاف بودند. بعد از انتقال کالوسها به محیط هورمون دار کالوسهای حاصل باززایی شدند. در این آزمایش از دمبرگهای دومین یا سومین برگهای رأس ساقه استفاده شد. (۹۹ و ۱۰۰)
کالوس را می توان برای مدت زمان طولانی یا کوتاه مدت حفظ کرد. این توانایی اکثراً به ژنوتیپ وابسته است. بعضی وقتها کشتهای طولانی مدت را می توان بوسیله افزودن سطوح بالای سیتوکینین وادار به جنین زایی کرد. این موضوع بوسیله استوارک و همکاران گزارش شده است. (۸)

مطالعه ای در سال ۱۹۸۵ روی جنین زایی و باززایی یونجه توسط مک کنزی و ناگاجان انجام شد. ده کولتیوار و لاینهای حاصل از دو گونه یونجه M.sative و M.media برای توانایی جنین زایی انتخاب شدند و گیاهچه های حاصل از ریشه و هیپوکوتیل در سه محیط جداگانه کشت شدند. این سه پروتوکول دارای مقادیر متفاوت از نمکها، ویتامینها و هورمونها بودند. پروتوکولی که مقادیر زیادی از ۲-۴-D و مقدار کمی از سیتوکسین داشت بیشترین کالوس جنین زا را تولید کرد. دولاین اصلاحی M.media که درصد بینابینی از نظر جنین زایی داشت درصد بسیار بالایی از باززایی را داشت. ریشه خزنده M.media بیشترین درصد جنین زایی را تولید کرد.

۳- جنین زایی
در سال ۲۰۰۲، Pasternak T.P و همکاران اثرات اکسین و pH را در فعالیت تقسیم سلولهای جنین زا در پروتوپلاست حاصل از برگهای یونجه بررسی کردند. اثرات جنین زایی در مقادیر پایین (M 1) و بالای (M 10) از ۲-۴-D تفاوت بود. سلولهای مواجه با میزان بالای ۲-۴-D دارای سیتوپلاسم متراکم گردید. کوچک باقی ماندند و توانستند به خوشه های سلولهای پیش جنینی تبدیل شوند. در حالی که سلولهای مواجه با ۲-۴-D پایین طول شدند ولی از بین رفتند یا کلنی تمایز نیافته دادند. در این بررسی ها از محیط m.s استفاده گردید.

در سال ۲۰۰۰، Iantcheva و همکاران میزان تشکیل جنین و باززایی را در محیطهای مایع در گونه های دیپلوئید Medicago شامل برگ و دمبرگ ۵ گونه M.ciliaris و M.murex و M.ombicularis و M.polymorpha و M.truncatula بررسی کردند. جنین ها به راحتی در محیط حاوی ۱mg/l یا ۲-۴-D 4mg/l بدست آمدند. آنها از محیط القاء B5 استفاده کردند و از غلظتهای متفاوت ۴۰ و ۱۱ و ۴ و ۳ و ۲ و ۱ و ۰۴ میلی گرم در لیتر از ۲-۴-D تکمیل شده با

۰۲m/l کاینتین، ۱mg/l آدنین و ۵۰۰mg/l میواینوزیتول استفاده کردند. مشاهده شد که حضور ۰۰۵mg/l و NAA برای بلوغ جنین سوماتیکی لازم است. رشد جنین گلبولی شکل تا رسیدن به مرحله تورپدو و در محیط B5 با ۲-۴-D 4mg/l انجام گرفت.
Walker و SATO در سال ۱۹۸۱ مقاله ای تحت عنوان مورفوژنز در کالوسهای Medicago sative و نقش یون آمونیوم در جنین زایی سوماتیکی منتشر کردند. آنها اظهار داشتند که وجود یون آمونیوم چه برای تولید ریشه چه برای جنین زایی سوماتیکی در شرایط In vitro ضروری است. مقدار یون لازم حدود
m 12.5 در محیط باززایی بود. بیش از m 50 یون آمونیوم به عنوان بازدارنده عمل کرد.

Arcyoni و همکاران در سال ۱۹۸۲ جنین زایی سوماتیکی را توسط کشت سوپانسیون پروتوپلاست و کشت مزوفیل برگ یونجه های M. corulea و M.glutinosa بررسی کردند. شرایط رشد گیاه، سن گیاه و ایزولاسیون پروتوپلاست بررسی شد و نتایج بدست آمده حاکی از آن بود که میزان مناسبی از اکسین و سیتوکسین در جنین زایی در گونه های مختلف M.corulea مؤثر است.

Kao و Myctayiuk (1980) کشت سوسپانسیون را در ۹ گیاه یونجه انجام دادند و نتایج نشان داد که شرایط غذایی متفاوت برای جنین زایی مورد نیاز است (ازجمله سطوح مناسب هورمونی و نمکهای معدنی) هفت گیاه از نه گیاه قابل تبدیل به گیاه کامل بودند.
– در سال ۱۹۸۵ Brown و همکاران نقش زمینه ژنتیکی را در جنین زایی سوماتیکی یونجه بررسی کردند. از ۷۶ کولیتوار یونجه متعلق به دو گونه sativa و falcate بدون توجه به پروتوکول، ریز نمونه و محیط های کشت، پاسخ متفاوتی بدست آمد.

در سال ۱۹۸۷ Meyyer و همکاران اثرات نیتروژن و ساکارز را در جنین زایی کلونهای حاصل از M.sativa بررسی کردند. یک نیاز مبرم به آمونیوم برای جنین زایی و تمایز مشاهده شد. اسید آمینه ها نه تنها برای تمایز ضروری تشخیص داده نشدند بلکه به عنوان مهارکننده هم عمل کردند. به جز ۱-۲g/l کازئین هیدرولیز شده یا ۴۴mM گلوتامین با ۳۰mM پرولین که در شرایط خاص ۲۰-۳۰% در افزایش جنین نقش داشت. ساکاروز زیاد یا کم مانع جنین‌زایی بود. کلونهای انتخاب شده از سه کولتیوار از M.sativa یک پاسخ مشابه به باززایی نشان دادند.

۴- باززایی
Ray و Bingham در سال ۱۹۸۹ باززائی در یونجه های دیپلوئید را مورد مطالعه قرار دادند. این مطالعات نشان داد باززایی توسط ژنهای محدودی کنترل می شود. Bertnard و همکاران (۲۰۰۱) روش نواری را برای جنین زایی یونجه گزارش کردند و نشان دادند در روشی که برگها همه قطعه قطعه شده و در محلول آنزیمی به همراه مانیتول بجای ساکاروز (به عنوان اسمز نگهدارنده) نتایج کشت پروتوپلاست موفق تر بوده و جنین زایی در B5 موفقیت آمیز بوده است.

تحقیق دیگری توسط علیرضا مطلبی آذر و علی جعفری مفید آبادی (۱۳۷۹) برروی کالزایی، جنین زایی و باززایی در جمعیتهای یونجه ایرانی انجام گرفت. آنها مجموع چهار روش موفق را بررسی کردند روش اول روش مک کوی و واکر بود که در آن از زیر نمونه هیپوکوتیل و محیط کشت پایه SH استفاده کردند. محیط القاء کال شامل
۲ ۲-۴-D+5NAA+2Kin محیط القاء جنین شامل۱۱ ۲-۴-D و ۱Kin بود. محیط باززایی Boi2y و در محیط بدون هورمون ۳۰ روز تولید باززایی کرد. در روش ونزل و براون از زیر نمونه دمبرگ در محیط کشت MS استفاده شد. محیط القاء کال شامل ۲Kin+5 2-4-D محیط القاء جنین شامل ۵ ۲-۴-D+2Kin و محیط باززایی MS بود. محیط القاء کال ۲ ۲-۴-D و ۰۲۵Kin در محیط القاء جنین شامل ۱۰ ۲-۴-D و ۱Kin محیط باززایی MS بدون هورمون بود. در روش آرسیونی و همکاران از ریزنمونه لپه استفاده شد و محیط کشت پایه MS، محیط القاء کال ۲ ۲-۴-D و ۰۲۵Kin و محیط القاء جنین ۰۲۵Kin و ۲ ۲-۴-D و محیط باززایی MS بدون هورمون بود. هر چهار روش پاسخ مناسبی در بر داشتند.

در سال ۱۹۸۴ آقای میتن (۷۳) و همکارانش بررسی ۳۵ کالیتوار یونجه را آغاز نمودند. در این آزمایشات تقریباً از هر یک از کولتیوار تعداد ۲۰ ژنوتیپ انتخاب گردید و بدور آنها استریل شده و در محیط آگار کشت داده شدند. سپس هیپوکوتیل بذور جوانه زده را در محیط کشت SHNAAK کشت نمودند. بافت کالوس در هفته های ششم تا هشتم بوجود می آید. وقتی حداقل ۲ گرم کالوس ایجاد شد آزمایش باززائی با روش Qalker و Sato آغاز می شود. کالوس های هر ژنوتیپ با هم مخلوط نموده و ۱۰ نمونه ۱۵۰ میلی گرمی از هر کدام در محیط کشت SH حاوی ۵۰ میکرومول ۲-۴-D و ۵ میکرومول کینینن است، کشت می گردد. بعد از ۳ روز بافت را به محیط بلایدس جاوی ۱۰۰ میلی گرم در لیتر اینوسیتول و ۲ گرم در لیتر عصاره مخمر منتقل می شود و در شرایط 0C37 و فتوپریود ۱۶ ساعت با شدت نور Jm-2s-16 نگهداری می‌شود. بعد از ۲۱ روز تعداد جنینهای تکامل یافته شمارش می شوند. و اگر جنین تشکیل نشده بود ابعاد اندامهای سبز نیمه ارگانیک یادداشت می شود.

در سال ۱۹۸۵ آقای می جر و همکارانش (۶۹) برای بررسی گیاهان یونجه دیپلوئید از ۱۹ کالتیوار استفاده نمودند. تعداد ژنوتیپ های مورد استفاده در هر کالتیوار متفاوت و بین ۵ تا ۵۸ ژنوتیپ بود. برای ضدعفونی سطحی بدور یونجه از اتانول ۷۰ درصد استفاده شد که به مدت ۱ دقیق درون محلول قرار می گیرد. و بعد به مدت ۱۰ دقیق در محلول ۱۰۰ میلی‌لیتری Hgcl2 2/0 درصد که قطره ای از Tween80 دارد ضدعفونی می گردد. سپس ۵ بار با آب مقطر شستشو می گردند. بذور ضدعفونی شده را در

محیط کشت MS بدون مواد تنظیم کننده رشد و حاوی ۲ درصد ساکارز و آگار ۸/۰ درصد کشت می دهند. تمام محیطهای کشت را در حرارت 0C121 به مدت ۲۰ دقیق انکوباسیون می نمایند. PH محیط کشت قبل از اتوکلاو شدن ۸/۵ می باشد. بذور در تاریکی و در حرارت 0C25 جوانه زده وقتی هیپوکوتیل ها به طول تقریبی ۵ سانتیمتر بعد از مدت ۲-۳ هفته رسید آنها را به شرایط فتوپریود ۱۶ ساعته به مدت ۲-۳ روز منتقل می نمایند. هیپوکوتیل ها را به ابعاد ۵ تا ۸ میلی متری بریده کوتیلدونها را برداشته و ساقه ها در همان محیط در ظروف ۱۰ سانتیمتری پلی کربناته کشت می دهند. به ازای هر گیاهک، ۳ اکسیدانت روی یکی از دو محیط کشت القاء کالوس درون پتریدیش های ۲×۶۰ میلی متری پلاستیکی قرار گرفتند. پتری دیش ها توسط پارافیلم مسدود شده و کلیه کشت ها در شرایط 0C25 و در تناوب نوری ۱۶ ساعته با شدت نور فلورسنت m mol m-2s-1 25 نگهداری شدند پروتکل های محیطهای کشت قراردادی برای جنین زائی سوماتیکی عبارتند از:

پروتکل I- برای القاء کالوس، ۳۰ روز در محیط کشت UM حاوی ۲۵/۰ میلی گرم در لیتر کینتین و ۲ میلی گرم در لیتر ۲-۴-D قرار می گرفتند و سپس برای تشکیل جنین به مدت ۳۰ روز در محیط کشت MS حاوی ۰۵/۰ کیلی گرم در لیتر BA و ۰۵/۰ میلی گرم در لیتر NAA قرار می گرفتند.
پروتکل II- برای تنشکیل کالوس، ۳۰ روز در محیط کشت B5h حاوی ۲/۰ میلی گرم در لیتر کینتین و ۱ میلی گرم در لیتر ۲-۴-D و برای القاء جنین، ۲۱ روز در محیط کشت SH حاوی ۱ میلی گرم در ایتر کینتین و ۱۱ میلی گرم در لیتر

۲-۴-D و در نهایت برای نمو و تکامل جنین ها در محیط کشت Boi2y قرار می گرفتند.
پروتکل مجدداً با اکسپلانت های پتیول از کشت ساقه کلیه ژنوتیپ های قابل باززائی و تعداید از ژنوتیپ های غیرقابل باززائی، تکرار شدند. در آزمایشاتی که از پتیول استفاده شده بود ۳ تکرار و هر تکرار حاوی ۵ پتیول ۵ تا ۸ میلی متری در هر پتریدیش استفاده گردید. جنین های سوماتیکی در محیط کشت SH را به آن ۰۲/۰ میلی گرم در لیتر ۲ip و IAA اضافه گردیده بود و یا در محیط کشت MS پایه که به آن ۲ درصد ساکارز اضافه شده بود کشت گردید.

آقای براون در سال ۱۹۸۵ به منظور مطالعه اثر متقابل محیط کشت × کالتیوار ۴ پروتکل مختلف بکار بردند. برای مطالعه اثر متقابل کالتیوار × اکسپلانت از دو اکسپلانت هیپوکوتیل و کوتیلدون استفاده نمود. در این آزمایش برای استریل نمودن اکسپلانت ها از اتانول ۷۰ درصد به مدت ۲۰ ثانیه و از محلول هیپرکلریت کلسیم ۷ درصد که به ازای
CC200 حاوی یک قطره Tween-80 است، به مدت ۲۰ دقیقه استفاده گردید و سپس با آب مقطر ۳ بار شستشو داده شد و برای ایجاد گیاه از جنین سوماتیکی بزرگ و سبز شده استفاده شد که با انتقال به محیط کشت She حاوی ۱۰ گرم در لیتر ساکارز، ۰۲/۰ میلی‌گرم در لیتر ایزوپنتیل آدنین این امر امکان پذیر گردید. جنین های فوق را در ظروف پلی‌کربناته ۴ اینچی حاوی ۵۰ میلی لیتر محیط کشت و به تعداد ۵ جنین در هر ظرف قرار می دهیم. (۲۶)
۳-۳- اثرات زمینه ژرم پلاسم در باززائی:
براون (۱۹۸۴) معتقد است که در یونجه بیشترین اختلاف ژنتیکی مشاهده شده در کالتیوارهای موجود می‌تواند از۹ منبع ژرم‌پلاسم که بین سالهای ۱۸۵۰ تا ۱۹۴۷ در‌ آمریکای شمالی بوجود آمده ناشی شده باشد. تقسیمات منابع‌ ژرم‌پلاسم بر اساس تعدادی از صفات صورت می گیرد اما بیشتر بر اساس تقسیمات جغرافیائی انجام می‌پذیرد. تمام ۹ منبع ژرم پلاسم قسمتی از ترکیب M.falcate×M.sativa هستند. که به آسانی با هم تلاقی می یابند و نسبت به میزان نسبی ژرم پلاسم M.falcate و M.sativa تغییر می‌یابند. بعلاوه ۹ منبع ژرم پلاسم مطابق با فشار سلکسیون طبیعی که در طی قرون متمادی اعمال شده است، تغییر می یابند.

اگر کالتیوارهای مورد بررسی در آزمایشات مختلف بر اساس میانگین واکنش جنین زائی مرتب شوند و بوسیله منابع ژرم پلاسم تفکیک شوند، الگوی مشخصی نمایان می شود. در اتین آزمایشات معلوم شده است که محدوده گسترده ای از کالتیوارهای دارای حداقل چند ژنوتیپ که قدرت باززائی دارند، می باشند، و بعضی از ژنوتیپ ها که تولید جنین نمی‌کنند، تولید اندامهای سبز و ساختمان نیمه ارگانیک می نمایند. تجربه نشان داده است که وجود اندامهای فوق نشانگر پتانسیل پائین باززائی ژنوتیپ ها می باشد. کالتیوارهائی که واکنش باززائی متوسطی دارند هم تولید جنین می کنند و هم تولید اندامهای سبز و نیمه‌ارگانیک. (۲۶ و ۳۱)

در بررسی می جر و همکارانش در سال ۱۹۸۵ که ۱۹ کالتیوار یونجه را بررسی نمودند چنین نتیجه گیری گردید که درصد ژنوتیپ هائی که تولید کالوس می کنند از ۵۳ درصد در لاین S2128 زیرگونه Caerula تا ۱۰۰ درصد در لاین MH2 زیرگونه xvaria متغیر بود. در این بررسی از دو محیط کشت UM و B5h استفاده گردید که محصول کالوس در B5h بیش از UM بود. بطور کلی ارقامی که پتانسیل باززائی بالائی هستند در هر دو محیط عملکرد بالائی هستند و بالعکس ارقامی که دارای عملکرد پائین هستند در هر دو محیط واکنش ضعیفی نشان می دهند. میزان کالوس حاصل از پتیول با هیپوکوتیل مشابه هم بود. در این آزمایش اکثریت لاین ها یا قابلیت باززائی کمی داشتند و یا واکنشی نشان نمی دادند. بهترین واریته از نظر تولید جنین سوماتیکی کالتیوار F2 از زیرگونه Falcata بود. در این کالتیوار جنین های سوماتیکی بعد از ۱۵ تا ۲۵ روز در م

حیط کشت UM قابل تشخیص بودند. در بعضی از موارد چنین بنظر می رسید که جنین ها بجای ایجاد شدن از کالوس مستقیماً از قطعات اکسپلانت بوجود می آید. در این کالتیوار کالوس های اولیه ۶۰ تا ۷۰ درصد از ژنوتیپ ها پس از ۳۰ روز تولید جنین های زیادی می کردند که تعداد آنها در محیط کشت UM بیش از B5h بود ژنوتیپ های F2 که در کشت های کالوس اولیه تولید جنین نکرده بودند، پس از انتقال به محیط کشت القا و جنین نیز تولید جنین ننمودند. در این کالتیوار بین ژنوتیپ های مورد بررسی تفاوت معنی داری از نظر وامنش جنین زائی رخ داد. بطوری که بعضی ژنوتیپ ها کالوس ترد، بیضی بدون جنین یا جنین های کم و بقیه کالوس نرم و آبدار نمودند. در این بررسی برخی ژنوتیپ های کالتیوار MH4 زیرگونه Xvaria، کالوس های اولیه، تولید جنین های بیشتری نمودند.

در تحقیقات Eltjo.G.M.Meijer که بررسی یونجه های دیپلوئید بود اگرچه لاین های ۴ زیرگونه مورد تحقیق، پتانسیل باززائی کمی نشان می دادند، ولی نتایج حاصل در مقایسه با گزارش Brown (1985) و Mitten (1984) در زمینه اثر منبع ژرم پلاسم روی تولید جنین های سوماتیکی یونجه تفاوت قابل ملاحظه ای وجود ندارد. در تحقیقات Eltjo تعداد زیادی از رقم و لاین های تتراپلوئید مورد بررسی. یا قابلیت باززائی نداشتند و یا تولید جنین های سوماتیکی کمی می نمودند. میزان کم باززائی امکان تحقیق وجود رابطه بین قابلیت باززائی و منابع ژرم پلاسم را امکان پذیر نمی نمود. درچند در این مطالعه بیشترین باززائی در هیبرید falcata cacrula و کالتیوار Falcata مشاهده شد، در صورتی که در مطالعات Mitten (1984) رقم بومی Ladak و در تحقیقات Brown

(۱۹۸۵) Ladak و زیرگونه falcate را بعنوان منابع برتر شناسائی نمودند. در این مطالعه یک استثناء وجود داشت، Regen-B که خود از یک رقم تتراپلوئید Regen-S که دارای پتانسیل باززائی بالائی است بوجود آمده است. با این وجود Regen-S حامل ژنهای زیان آوری است که در حالت دیپلوئید فراوانی این ژنها افزایش می یابد. بنابراین افزایش ژنهای نامطلوب می توانست علت واکنش ضعیف و دور از انتظار Regen-B باشد (۳۳).

آقای براون در سال ۱۹۸۸ به این نتیجه رسید که طور قابل توجهی ۸۰ درصد کالتیوارهائی که دارای باززائی هستند از نظر فنوتیپی بعنوان تیپ های ریشه خزنده طبقه بندی می شوند. آقای موری در سال ۱۹۵۷ رفتار ریشه های خزنده و مسیر تکاملی ساقه های نابجا را که از قطعات ریشه بوجود می آیند شرح داده است. این کالتیوارها بوسیله جداسازی جانبی، انشعاب مکرر ریشه ها و نمو ساقه های نابجا در فواصل ریشه ها مشخص می شوند. واضح است که منشاء ساقه های نابجا، فلوژن نزدیک ریشه های جانبی است. راجع به تظاهر ژنتیکی رفتار ریشه های خزنده اطلاعات کمی موجود است. بهرحال آقای بورتون (۱۹۳۷) معتقد است که این صفت ممکن است

توسط تعداد زیاید ژن کنترل شوند و آقای رام باق معتقد است، منشاء این ژنها از منابع ژرم پلاسمی M.falcate و یا Ladak می باشد. بینگهام (۱۹۷۵) نیز ارتباط بین صفت ریشه های نابجا و باززائی را گزارش کرده است. اما نظریه بینگهام، نظریه براون را تأئید نمی کند. این همبستگی نشان می دهد که ممکن است ارتباطی بین ظرفیت تشکیل جنین های سوماتیکی و تکامل ساقه های نابجا در فواصل ریشه وجود داشته باشد. بهرحال تحقیقات آقای رام باق (۱۹۸۲) نشان می دهد که هرچند صفت خزندگی ریشه از ژرم پلاسم M.falcate به ارث می رسد، اما بنظر می رسد که ارتباط مستقیمی با تشکیل جنین های سوماتیکی نداشته باشد.
اگر بین این دو صفت رابطه وجود داشت، بایستی انتظار داشت که هر دو صفت همراه با سلکسیون، بر له و علیه آنها، کاهش و افزایش نشان دهد. واکنش جنین زائی سوماتیکی در محدوده سلکسیون ریشه ها خزنده اختلاف معنی داری با شاهد ندارند. (۲۴)

در تحقیقات براون (۱۹۸۸) مشخص کردید مفهوم ارتباط تشکیل جنین با زمینه ژنتیکی این است که تکثیر کالوس خوب ممکن است لازمه تولید خوب باشد. بهرحال ارتباط مشاهده شده بین باززائی و ژرم پلاسم بنظر می رسد که برای باززائی و کالوس وجود نداشته باشد. این مسئله در بررسی های می جر و همکارانش ۰۱۹۸۵) به این صورت تعریف می شود که کالتیوارهائی که دارای بهترین باززائی بودند در زمینه ژرم پلاسمشان با هم تفاوت داشتند و در بررسی ژرم پلاسم وحشی یونجه توسط داجاک و همکارانش (۱۹۸۷) که روی مواد حاصل از پروتوپلاست صورت گرفت اثر ژنوتیپ های با باززائی بالا بوسیله فقدان تولید کالوس مشخص می شوند (۲۴ و ۲۶)

در باززائی Medicago sativa ژنوتیپ ویژه و فقط تعداد کمی ژنوتیپ در بعضی کالتیوارها برای توانائی شان جهت باززائی گیاه از ریز نمونه جداسازی شده است. (۱۶)
پتانسیل باززائی به نتایج یک گیاه ساراناک منتقل گردید که نشان می دهد باززائی قابل توارث می باشد. از گزینش دوره ای برای تجمع آللهای کنترل کننده صفات ژنتیکی مطلوب برای تولید رقم “Regen S” که فراوانی باززائی بالائی دارد مورد استفاده قرار گرفته است. در جریان توسعه و ایجاد یونجه “Regen S” از میان ۱۲ درصد از ژنوتیپ هایی که از کشت هیپوکوتیل باززائی کرده بودند، در اولین نسل گزینش یک کلنی «دوپریت Duprait» و چهار کلنی «ساراناک» انتخاب گردید. پنج گیاه از طریق آمیزش بین گونه ای با یکدیگر تلاقی داده شدند و نتایج حاصل به منظور بررسی باززائی مورد آزمون قرار گرفتند. اولین نسل گزینش در افزایش فراوانی ژنوتیپ های تولید شده در نسل دوم تا سطح ۵۰ درصد مؤثر بوده اند. در نسل دوم ۲۵ گیاه با باززائی شده گزینش گردیده و آمیزش یافتند تا جمعیت سومین نسل و نسلهای بعدی گزینش را بوجود آورند. در این تسل ۶۷% ژنوتیپ ها با باززائی کردند و ۷۵ گیاه با بازائی شده آمیزش یافتند تا “Regen S” را بوجود آوردند. در حین سه نسل گزینش دوره ای فراوانی باززائی از ۱۲ درصد تا

۶۷% افزایش یافت که این مورد وراثت پذیری بالای صفت را نشان می دهد. یکی دیگر از استرین های قادر به باززائی یونجه بنام “Regen Y” می باشد که دارای توارث «صفت باززائی بالا» می باشد. وراثت پذیری بالای باززائی همچنین جهت اصلاح کلون یونجه HG2 برای استفاده در کشت سوپانسیون و گزینش سلول سوماتیکی بکار برده شده است

(۲۳ و ۲۴)
ریش و بینگهام (۱۹۸۰) نتیجه گرفتند که مدل دو ژن غالب، تمایز جوانه را کنترل می کند ]۸۹[. در سطح تتراپلوئید، وان و همکاران (۱۹۹۸) نتیجه گرفتند که جنین زائی سوماتیکی تحت کنترل دو ژن غالب با اثرات تکمیلی است. میجر براون (۱۹۸۷) اظهار داشتند که دو مسیر متمایز توسعه ای ۰نموی) برای جنین زائی سوماتیکی در یونجه وجود دارد. نتایج آنها از مطالعات مقایسه ای ژنوتیپ های گزینش شده از کالتیوار رنجلندر، رابلر، ورنال تا Regen-S، یک جمعیت یونجه با جنین زائی بالا که بوسیله دگر کشنی ژنوتیپ های جنین زا که از کالتیوار Dupuits و Saranac (بینگهام و همکاران ۱۹۷۵) (۲۰) توسعه یافته، بدست آمده است. (۷۱).
برخی از نتایج عمومی که در باززائی از کالوس و مطالعات مستقل صورت گرفته در برگیرنده محدوده کاملی از ژرم پلاسم یونجه است. این موارد عبارتند از:

۱- باززائی یک خصوصیت ژنتیکی است و وراثت پذیری بالائی دارد.
۲- اکثر کالتیوارها، لاینها و منابع ژرم پلاسم حاوی ژنوتیپ هایی با توانائی باززائی هستند.
۳- فراوانی ژنوتیپ های دارای خاصیت باززائی در اکثر ارقام حدود ۱۰% است.
۴- ارقامی نظیر لاداک و رنجلندر وجود دارند که توانائی باززائی استثنائی دارند.
۵- ارقامی با توانائی باززائی می توانند توسط روشهای اصلاحی مرسوم ایجاد گردند.

۶- ارقامی که از ریشه آنها جوانه های فرعی یا نابجا بوجود می آید (یونجه هایی با ریشه های خزنده) باززائی بالائی دارند.
۷- برخی ژنوتیپ های M.falcate و M.corula قادر به باززائی هستند.
۸- رانده مان باززائی (تعداد جنین به ازاء هر پلات آزمایشی) را می توان توسط بهبود محیط کشت افزایش داد.
۹- باززائی در یونجه اصولاً از طریق جنین زائی سوماتیکی صورت می گیرد.
۱۰- اساساً هر بافت ریز نمونه بدست آمده از ژنوتیپ باززائی کننده که کالوس تشکیل دهد می تواند به گیاه باززائی شود (۲۴).

انواع کشت بافت گیاهی:
کشت بافت را می توان بر اساس نوع بافت کشت شده به انواع زیر تقسیم نمود:
۱- کشت جهت تولید کالوس:
اگر یک بافت تمایز یافته از گیاه جدا شده و تحت شرایط آزمایشگاهی کشت گردد و تولید توده تمایز نیافته ای به نام کالوس نماید آنرا کشت کالوس گویند. (۱)
۲- کشت جنین:

در این نوع کشت پس از حذف پوسته بذر، جنین از بذر رسیده یا بذر نارس جدا شده و به عنوان جنین رسیده یا جنین نارس کشت می گردد. (۱)
۳- کشت اندام گیاهی:
شامل کشت برگ، دانه کامل، دانه نصفه، مریستم، نوک ساقه، ریشه، پرچم، تخمدان و سایر اندامها می باشد. (۱)
۴- کشت سلولی یا کشت معلق:
سلولهای منفرد که با استفاده از آنزیمها یا با روشهای مکانیکی از یک بافت گیاهی یا کالوس بدست می آیند و در محیط مایع در حین تکان دادن کشت می گردد. (۱)

۵- کشت پروتوپلاست:
به کشت پروتوپلاستهایی که در اثر هضم آنزیمی دیواره سلولی آن بوجود آمده اند اطلاق می شود. (۱)
کشت سوسپانسیون:

از نظر تعریف به مجموعه ای از سلولها که در یک محیط کشت مایع شناور بوده و رشد و تکثیر پیدا می کنند سوسپانسیون سلولی گفته می شود. سوسپانسیون سلولی معمولاً با انتقال قطعاتی از کالوس به یک محیط کشت مایع بوجود می آید. البته این محیطهای کشت باید مرتباً توسط یک تکان دهنده تکان داده شوند که این کار باعث هوادهی به سلولها شده و از تجمع مواد رسوبی جلوگیری می کنند (۸۱) اولین بار در سال ۱۹۵۶ ای. ام. شانتر، کشت تعلیقی نمونه ای از ریشه هویج را گزارش نمود. وی توانست از این نوع کشت بافت، گیاهچه ای جدید ایجاد کند. ظروف حاوی این نوع کشت سلولی را معمولاً در دستگاههای چرخنده و یا تکان دهنده قرار می دهند، تا از چسبیدن سلولها به همدیگر جلوگیری شود. مواد متشکله ماده غذایی محلول کاملاً شبیه موادی هستند که در ماده غذایی نسبتاً جامد برای رشد کالوسها بکار برده می‌شود با این تفاوت که شامل آگار نمی باشد. ]۸۱ و ۴۸[

اگر تکه های کالوس به محیط غذایی مایع منتقل شوند و محیط کشت شیکر مرتباً تکان داده شود، ممکن است سلولهای منفرد یا توده های متشکل از چند سلول در محیط جدا شوند. این سلولها در اثر تقسیم مجموعه سوسپانسیون سلولی را تشکیل می دهد. همچنین، ممکن است از یک سلول منفرد و یا توده کوچکی از سلولها که بصورت مکانیکی جدا شده اند، گیاهچه تولید نمود. بازیابی گیاه از کشتهای سوسپانسیون سلولی مشکل تر از بازیابی گیاه از بافت کالوس می باشد. کشت معلق معمولاً از کالوس تهیه می شود زیرا سلولهای آن به آسانی از هم جدا شده و به راحتی باززایی صورت می گیرد. ]۴۸ و ۴۹[
مراحل رشد کشت سلولی:

پس از اینکه نمونه گیاهی مثلاً کالوس در محیط کشت مایع قرار گرفت، در ابتدا برای مدتی هیچگونه رشد و افزایش قابل توجهی در تعداد سلولها مشاهده نمی‌گردد. به این مرحله، مرحله رکود اولیه گفته می شود. سپس تعداد سلولها به صورت تصاعدی افزایش یافته و سپس افزایش سلولی به صورت خطی ادامه می یابد پس از آن سرعت تقسیم سلولی بتدریج کاهش یافته و وارد مرحله ثابت می شود. (۹۷ و ۹۹)
زمان واکشت هنگامی است که تعداد سلولها در حد ماکزیمم در واحد حجم باشد.
ضمناً اگر تعداد سلولها در محیط کشت خیلی کم باشد تکثیر بلندی صورت می گیرد یا متوقف می شود (۹۷)
برای واکشت تا مقداری از سلولهای سوسپانسیون را به محیط کشت تازه اضافه می کنیم یا اینکه مقداری از محیط کشت تازه تهیه شده و استریل را به محیط کشت قبلی مجموعه همراه با مجموعه سوسپانسیون اضافه می کنند]۹۸[
مبحث کشت سوسپانسیون در یونجه برای تولید بذر مصنوعی مورد توجه قرار گرفت.]۷۱ [

بذر مصنوعی یونجه و کاربرد آن:
بذر مصنوعی پدیده نوینی است که مشابه بذور بوتانیکی می باشد و شامل یک جنین سوماتیکی است که با یک پوشش حفاظتی احاطه شده است. پوشش بذر مصنوعی بایستی خطری برای جنین نداشته باشد و جنین را در مراحل کشت، حمل و نقل و نگهداری، حفاظت نماید و همچنین اجازه رشد به جنین بدهد بدون اینکه تغییراتی را پدید آورد. بذور مصنوعی ممکن است حاوی مواد غذایی به شکل اندوسپرم مصنوعی و نیز مواد لازم برای رشد و نمو باشد. پوسته دومی نیز ممکن است برای ممانعت از خشک شدن کپسول بکار رود. (۱۹ و ۲۰ و ۲۱)

بسیاری از گیاهان که از طریق کشت بافت و سلول تکثیر می شوند، اغلب نمی توانند بوسیله بذر تکثیر یابند. بعلت کاهش ثبات ژنتیکی صفات مطلوب در این گیاهان نمی توان از بذور آنها استفاده نمود. برای غلبه بر این مشکل، تکثیر از طریق کشت بافت می تواند مفید واقع شود. اما در اغلب گیاهان زراعی استفاده از این تکنیک پرهزینه است.
در ضمن استفاده گلخانه ای، تکثیر قلمه و ساقه نیز پرهزینه بوده و بوسیله گیاه مادری محدود می شود یا بعبارتی تعداد محدودی از هر گیاه بدین روش می توان تهیه نمود در صورتی که این محدودیت بوسیله استفاده از سیستم بذر مصنوعی از بین می رود. (۱۹ و ۲۰ و ۲۱ و ۷۱)
کاربرد بیوتکنولوژی:

بیوتکنولوژی کاربردهای بالقوه زیادی برای بهبود و اصلاح یونجه ارائه می‌دهد. ژنهای زیادی در یونجه که برای مهندسی ژنتیک پیشنهاد شده و روی آن کار صورت گرفته زیاد می باشد. ژن مقاومت به علف کش، ژن هضم کننده آنزیمهای هضم پروتئین ژن مقاومت به آلومینیم و ; که توسط مهندسی ژنتیک مورد مطالعه قرار گرفته است. (۱، ۷ و ۹)
کاربرد دیگر بیوتکنولوژی، انتخاب سلولی است، وقتی یک صفت در سطح یک سلول بروز می کند. در یونجه لاین های سلولی مقاوم به ایتونین و سموم فوزاریوم شناسائی و از آنها استفاده شده است. همچنین شناسائی و کاربرد لاین های سلولی مقاوم به شوری خشکی که بطور عمده ای در یونجه مورد بحث قرار می گیرد. (۱۹ و ۲۳ و ۳۷ و ۳۸)
جدایی جنین و تکنیک های کشت پروتوپلاسم برای هیبریداسیون سوماتیکی یونجه بکار می رود. با این روش می توان بین گونه های یکساله Medicago و سایر حبوبات مثل اسپرس هیبریدهائی تهیه نمود که در حالت معمولی امکان آن نمی رود. (۱۹ و ۲۳ و ۴۷)

پتانسیل بذور مصنوعی:
جنین های سوماتیکی یا بذور مصنوعی متدی را برای ایجاد گیاه فراهم می کنند که از طریق کشت بافت میسر می شود. (۷۱)

کاربرد بذر مصنوعی:
دلیل عمده بهبود بذور مصنوعی رسیدن به ایجاد ثبات و عمل کرد مطلوب است. تکنیکهائی مثل تکثیر رویشی و تولید بذور هیبرید و قلمه که بطور قابل ملاحظه ای یکنواختی را افزایش می دهند، در بسیاری از واریته ها مطلوب نبوده و یا پرهزینه است. تکنولوژی بذور مصنوعی می تواند منابع موجود در سیستم های تکثیر گیاهی مثل ریزازدیادی و قلمه را فراهم نماید. سودمندی عمده بذور مصنوعی تولید در مقیاس بالا و با هزینه کم می باشد. اگرچه سیستم بذور مصنوعی می تواند بسیاری از نواقص متدهای دیگر جبران کند، اما پذیرش این تکنولوژی به اهمیت گیاه و هزینه تولید، بستگی دارد (۷۳)

از نظر تئوری، توانائی کاربرد یک پروپاگول (propagule) کوچک چند میلیمتری به جای یک گیاه یا نهال بزرگ چند سانتیمتری، انعطاف پذیری زیادی را برای تکثیر در مقیاس یالا فراهم می کند. هرگاه یک پروپاگول به اندازه یک بذر قابل تولید باشد، انتخاب گونه ها برای ازدیاد کلنی های گیاهی وسعت یافته و محصولات برای عملکرد و شرایط محیطی می توانند بهبود یابند. اندازه پروپاگول ها برای نگهداری کشت، حمل و نقل و ; بخوبی وقتی تعداد زیادی از آنها مورد نیاز باشد، مهم است در صورتی که مواد گیاهی بزرگتر برای طی مراحل فوق سخت تر و پرهزینه تر خواهد بود. با کشت مستقیم پروپاگول ها در خاک مراحل قبل از کشت که معمولاً جهت سازگاری بکار می رود، خودبخود حذف خواهد شد.

بذور مصنوعی برای تکثیر هیبریدهائی که با دست گرده افشانی شده اند، ژرم‌پلاسم گیاهی و گیاهانی که دست ورزی ژنتیکی شده اند، بخصوص برای تکثیر ژنوتیپ های تاپایدار و عقیم بکار می رود، استفاده از بذور مصنوعی، نیازمندی به تشکیل ثبات میتوزی در تغییرات ژنتیکی را حذف می کند و ممکن است برای حفاظت نیز سودمند باشد. بذور مصنوعی وقتی که باروری بذر کاهش می یابد، مثل هیبریداسیون بین گونه ای و بین جنسی، در ترکیب مواد ژنتیکی مختلف مناسب خواهد شد. در این تلاقی ها که یا بصورت جنسی و یا غیرجنسی صورت می گیرد، مثل استخراج سیتوپلاسمی، تولید سیبرید، انتقال ژن منفرد، تکنیک بذر مصنوعی مفید خواهد بود. (۲۰ و ۲۱ و ۲۳ و ۴۵)

آقای Redenbaugh و همکارانش (۱۹۸۴ و ۱۹۸۶) کشف کردند که هیدروژل‌هائی مثل آلژینات سدیم می تواند برای تولید بذور مصنوعی بکار روند. فراوانی تولید گیاه از بذور مصنوعی یونجه ۸۶ درصد در شرایط invitro و ۲۰ درصد در شرایط گلخانه ای بود. آقای Vamdkawd در سال ۱۹۸۴ در یک کنفرانس در ژاپن می گوید: اگر یک جنین کاذب از هر سلول کشف شده بوجود آید، می توان بوسیله بعضی از تیمارها، آنها را نگهداری نمود و بفروش رساند و کشاورز نیز به آسانی می تواند از آنها استفاده کند و این بذور می توانند جانشین بذور حقیقی شوند و با این تغییر سیستم های اصلاح نباتات نیز تغییر می یابد. او مشاهده نمود که محدودیت های زیادی در این متد وجود دارد. آقای

Walgate می گوید ما می توانیم همیشه جنین های سوماتیکی یونجه را در یک نوع لعاب بپوشانیم و به رویش ۱۰۰ درصد برسانیم ولی جزئیات کار خویش را ارائه ننمودند. Syluie binachi نیز مشخص می کند که جنین های سوماتیکی یونجه انتخابی می توانند با آلژینات سدیم کپسوله گردند. البته جنین های سوماتیکی سایر محصولات نیز دارای پتانسیل کپسوله شدن هستند، اما نتایج حاصله از این محصولات بخوبی کپسولهای یونجه نیست. Lutz و همکارانش روی جنین های هویج کار کردند. آنها جنین های سوماتیکی هویج را با لایه ژلاتین کپسوله کردند. و این جنین های مصنوعی، جوانه زده و از کپسول خود خارج شدند. نتیجه تحقیقات آنها این بود که عامل محدود کننده تولید گیاه در این سیستم، کیفیت پائین جنین های سوماتیکی است.

 

امکانات مورد نیاز برای کشت بافت و سلول گیاهی:
اندازه و وضعیت کشت بافت و وسعتی که آماده شده، بوسیله طبیعت ناشناخته و فراهم بودن سرمایه تعیین می شود. بهرحال یک آزمایشگاه کشت بافت وسایل و آمادگی های زیر را فراهم خواهد کرد (الف) شستشو و نگهداری وسایل شیشه ای وسایل پلاستیکی و دیگر لوازم آزمایشگاهی (ب) تدارک، استریل کردن و نگهداری محیطهای کشت (ج) استریل ساختن مواد گیاهی (ح) حفظ و نگهداری کشت ها در شرایط کنترل شده از نظر دما، نور و در صورت امکان رطوبت (هـ) مشاهده کشت ها

حداقل دو آزمایشگاه و یا دو اطاق مجزا بایستی بدین منظور فراهم کرد. یکی برای شستشو و نگهداری وسایل آزمایشگاهی و تدارک محیطهای کشت که به آن اطاق محیط کشت (Media room) می گویند و دیگری اطاق یا آزمایشگاهی است که بمنظور نگهداری کشت ها فراهم می شود که به آن اطاق کشت (Culture room) گویند. اطاق کشت بایستی دارای یک میز مشاهده کشت مجهز به بیونوکولر بوده و به قدر کافی دارای نور بسته به شرایط محیطی آزمایشگاه، کابینت انتقال استریل بایستی در اطاق کشت، در گوشه آزمایشگاه معمولی و یا بصورت اطاق انتقال ویژه، تعبیه شود.
وسایل معمول مورد نیاز برای تهیه محیط کشت شامل موارد زیر می باشد:

الف- جای ظروف با ارتفاع مناسب برای کارهای ایستاده.
ب- فریزر با برودت بسیار بالا برای نگهداری محلول ذخیره، محلول ها یانزیم، شیر و نارگیل و ;
ج- یخچال برای نگهداری مواد مختلف شیمیایی، مواد گیاهی، نگهداری کوتاه مدت محلول های ذخیره و ;
د- تنگ پلاستیکی برای ذخیره آب مقطر.
هـ – ترازو.
و- هات پلیت (hot plate) با همزن مغناطیسی برای حل مواد شیمیائی.
ز- PH متر.
ح- یک هواکش یا پمپ خلاء برای تسهیل در امر استریلاسیون.
ط- دیگ بخار برای گداختن آگار.
ی- اتوکلاو یا خوراک پز فشاری خانگی برای استریلاسیون محیطهای کشت.
یخچال . فریزر وسایل فوق را می توان در سالن یا اطاقی خارج از اطاق محیط کشت قرار داد. ترازو نبایستی در اطاق محیط کشت نگهداری شود.
اطاق کشت:

بحث و نتیجه‌گیری

فصل چهارم
بحث و نتیجه گیری:
انتخاب ارقام یونجه:
جهت مقایسه کال زایی، جنین زایی و باززایی گیاه از بذور جمعیتهای قره یونجه، رنجر و واریته سنتتیک دانشکده کشاورزی تبریز استفاده شد.
محیط القاء کال:

در مورد ریز نمونه های برگ و هیپوکوتیل حدوداً ۴ روز بعد از قرار دادن ریزنمونه ها در محیط القاء کال، اولین علایم آغازیدن کال روی ریز نمونه ها مشاهده شد. به این صورت که ابتدا هیپوکوتیل متورم و سپس اپیدرم لایه لایه شده و سلولهای زیرلایه اپیدرمی شروع به تقسیم کرده و کال زایی آغاز شد. پس از ده روز براحتی کال در زیر نمونه ها قابل مشاهده بود. (شکل ۳و۴و۵) در مورد ریزنمونه بذر پس از ۷ روز از قرار دادن ریزنمونه ها در محیط القاء کال اولین علائم آغازیدن کال روی ریزنمونه ها مشاهده شد به این ترتیب که بذرها متورم شده و سپس کال زایی آغاز شد پس از ۱۴ روز براحتی کال در ریزنمونه ها قابل مشاهده بود. بعد از ۲۰ روز، کال رشد کرده از ریزنمونه های برگ و هیپوکویتل آماده بازگشت شد و کالهای حاصل از ریزنمونه بذر پس از ۳۰ روز آماده بازگشت شد. کالوسهای بدست آمده کرمی و ترد بودند (شکل ۶ و ۷). قبل از بازگشت از آنجا که همه نمونه ها در محیط SH، ۱۰۰ درصد جنین‌زایی داشتند، فقط قطر کالها به عنوان فاکتور مورد اندازه گیری بررسی شد.