فایل ورد کامل فرآیند دیافیلتریشن و کاربردهای آن در تصفیه

                                                                                             
 
مقدمه:
   روش نمک زدایی آب مدت مدیدی است که توسط کشورهای مختلف در سراسر جهان برای تولید یا افزایش ذخایر آب آشامیدنی مورد بهره برداری قرار گرفته است.
از کل آب های کره زمین، ۹۴ درصد آن آبهای شور اقیانوسها و دریاها می باشد و تنها ۶ درصد آن آب خالص است که از این میزان آب خالص هم ۲۷ درصد آن به صورت کوه یخ است و تنها ۷۳ درصد آن آبهای زیر زمین قابل استفاده می باشد، که با این تفاسیر روش های نمک زدایی از اهمیت بسیاری در تامین آب مورد نیاز را دارا می باشند. روشهای تجاری قابل دسترسی نمک زدایی به صورت زیر می باشند:

               روشهای گرمایی
۱- روش های اصلی:
              روشهای غشایی

۲- روشهای فرعی:

که در این روشها، روش اسمز معکوس با ۴۲ درصد و تقطیر سریع چند مرحله ای با ۴۴ درصد بیشترین درصد نمک زدایی آبها را در جهان در بر می گیرد.

برای نمک زدایی نمونه های بیولوژیکی معمولا روش های دیگری را به کار می برند که یکی از این روش ها که بسیار مهم و کارآمد می باشد روش دیافیلتریشن می باشد، که روشی سریع و موثر برای نمک زدایی یا تغییر بافر نمونه های بیولوژیکی است  (یا فیلتریشن روشی است که غشاهای فراپالایش (پالایش از لابه لای صافی ای که قادر به گذراندن ذرات بسیار ریز میکروسکوپی باشد). را برای تغییر، جابجایی یا کم کردن غلظت نمک یا مواد حل شده در محلول شامل پروتئین ها، پپتدیها، نوکلئیک اسید و مولکول های دیگر می باشد مورد استفاده قرار می دهد.
    در این حال با انتخاب صافی های غشاء نفوذپذیر (تراوا) برای جداسازی اجزاء محلول بسته به اندازه مولکول به کار برده می شود. یک غشاء با فراپالایش مولکول هایی را که بزرگتر از منافذ غشایء هستند را در خود نگه می دارد. در حالی که مولکول های کوچکتر مثل نمک و مواد محلول در آب که قابلیت نفوذ پذیری ۱۰۰ درصد دارند، به راحتی از غشاء عبور می دهد.
دو روش برای این نوع تصفیه (یا فیلتریشن) وجود دارد:
۱- تصفیه ناپیوسته- رقیق سازی مداوم:
   در این روش نخست نمونه را با آب یا بافر دیگر، به حجم از پیش تعیین شده رقیق می کنند، سپس نمونه رقیق شده با فراپالایش، غلیظ شده و به حجم اصلی اش بر می گردد. این مرحله آنقدر تکرار می شود تا زمانی که نمک، مواد حلال در محلول یا مولکول های کوچکتر خارج شوند. با هر مرحله رقیق سازی مداوم، مولکول های کوچک بیشتری خارج می شوند. این نمونه معمولا با یک حجم مشخص از بافر رقیق می شود.
شکل ۲

۲- تصفیه پیوسته:
روش تصفیه (که به تصفیه حجم ثابت هم معروف است) شامل شستشوی نمک های بافر اصلی (با انواع مولکول های کم وزن تر) در نمونه ابقاء که با اضافه کردن آب یا بافر جدید به محلول ابقاء که با همان میزان صافی تولید شده است می باشد. در نتیجه، حجم محلول ابقاء و غلظت تولید شده در طول مراحل تصفیه تغییر نمی کند. اگر آب برای تصفیه به کار رود، نمک ها شسته شده و قدرت رسانایی کاهش می یابد. میزان نمک خارج شده، متناسب با حجم محلول ابقاء به حجم تصفیه تولید شده مربوط می شود حجم تصفیه همان حجم محلول ابقا در زمان شروع تصفیه است. با استفاده از روش تصفیه پیوسته، بیش از %۵/۹۹ از %۱۰۰ محلول نفوذپذیر می تواند با شستشو از بین ۶ حجم محلول ابقاء خارج شود.
جدول ۱

سیر تحولی تصفیه و تخلیص سرمهای درمانی
  در میان سرم های درمانی که توسط پادزهر اسب تهیه می شود به صورت خام به مصرف می رسید یعنی پس از تزریق آزهای معینی از زهر به بدن حیوان و خون گیری از حیوان، خونهای گرفته شده توسط وزنه های سربی، خونابه خارج شده و سرم جدا می گشت و پس از افزایش فنل به آن برای مدت مدیدی در سردخانه نگهداری می شد.
مشکل این روش این بود که استفاده از سرم اسبی برای بار دوم معمولا با عوارض و آلرژی توام بود به دلیل این که سرم دارای آلبومین ها و پروتئین های غیر اختصاصی سرم اسب بود و بدن بیمار به تمامی پروتئین های موجود در سرم اسب حساس می شد. از این رو مسأله تصفیه سرم و تخلیص آن از اهمیت زیادی برخوردار گردید.
از میان تکنیک های متعدد تصفیه و تخلیص پروتئین ها روش های رسوبی متداولترین و با سابقه ترین روش جداسازی پروتئین پلاسما محسوب می شود که روش های متعددی را شامل می شود که عبارتند از: رسوب دادن با تغییر PH، رسوب دادن توسط کاهش قدرت یونی و رسوب دادن توسط افزایش قدرت یونی.
پدیده Salting out شالوده تعدادی از تکنیک های مهم جداسازی و تخلیص هاست که با ایجاد غلظت بالایی از نمک خنثی در محلول پروتئینی و رسوب دادن بخشی از پروتئین ها موجب تفکیک و خالص سازی و تغلیظ آنها می گردد. مشخص گردیده که بین حلالیت نمک و تاثیر آن در رسوب پروتئین ها رابطه مستقیمی وجود دارد.
 یون های نمک اکثر مولکول های قطبی محیط (حلال) را به طرف خود جذب کرده و اطراف مولکول های پروتئین از آنها خالی می گردد. و متعاقباً به دنبال برخوردهای تصادفی و مولکول های پروتئین با یکدیگر تجمع مولکولی ایجاد و رسوب تشکیل می شود.
و متعاقباً بدنبال برخورد های تصادفی مولکول های پروتئین با یکدیگر تجمع مولکولی ایجاد و رسوب تشکیل می شود.
 هرگاه نمک به محیط اضافه شود مولکول های حلال قطبی از اطراف پروتئین به طرف یون های نمک جذب می شود و مولکول های پروتئین به طور تصادفی در مجاورت یکدیگر قرار می گیرند. در حالی که لایه آب به شکل موثر وجود ندارند تا مانع جذب آنها به یکدیگر شود، در نتیجه تجمع یافته و تشکیل رسوب می دهند. پروتئین های بزرگتر که سطح بیشتری دارند با مقادیر کمتر نمک رسوب می دهند و مولکول های کوچکتر که گروه های غیر قطبی کمتری دارند در غلظت های زیادتر نمک رسوب می کنند.
 
S = حلالیت         = قدرت یونی محلول
 = عرض از مبدأ     = شیب خط یا salting out come
میزان تاثیر نمک در پدیده مورد بحث به طبیعت آنیون و کاتیون، حاصل از تفکیک یونی نمک خصوصاً به آنیون آن مربوط می شود. موثرترین آنیونها، آنیونهای چند ظرفیتی و موثرترین کاتیونها، انواع یک ظرفیتی آنها می باشند.
Anion:  
Ration:  
نمک های که در این تکنیک ها استفاده می شود باید حتی المقدور خالص بوده و از حلالیت بالایی برخوردار باشند. که   سولفات آمونیوم به دلیل ارزافی و حلالیت مناسب بیسش از سایر نمک ها به کار گرفته می شود.
در موسسه واکسن و سرم سازی رازی از سولفات آمونیوم برای رسوب پروتئین ها و تهیه سرم استفاده می شود، بدین صورت که در مراحل مختلف تصفیه درصدهای متفاوتی از سولفات آمونیوم را به سرم اضافه کرده و رسوبات را جدا کرده و عمل تصفیه و تخلیص انجام می شود. پس از تصفیه آزمون های مختلفی بر روی این سرم ها انجام می شود تا شرایط خوب سرمها تایید شود که این آزمون ها به دو صورت می باشد. یکی آزمون های فیزیکو شیمیایی که شامل؛ اندازه گیری PH، وزن خشک، نیتروژن پروتئین (به دو روش کجدال و بیوره) و … می باشد. و آزمون های بیولوژیکی که شامل: آزمون پیروژنی، پوتنسی، سلامت و ایمنی و …. می باشد که فقط آزمون های فیزیکوشیمیایی در این مقاله توضیح داده می شود و از آزمون های بیولوژیکی هم فقط پوتنسی شرح داده می شود. غلظت یون هیدروژن یا PH: که توسط دستگاه PH متر الکترونیکی اندازه گیری می گردد و برای سرم ها از ۲/۷-۴-۶ باید باشد.
وزن خشک: حدود ml1 از سرم را در شرایط خلاء درون آن در دمای ۷ ۳۷ برای مدت ۲۴ ساعت قرار می دهیم و سپس توزین می نماییم.

نیتروژن پروتئین به روش کجلدال:
   این روش برای تعیین نیتروژن مواد آلی به کار می رود که با ضرب در عددی ثابت می توان میزان پروتئین را به دست آورد (۲۵/۶ برای گوشتها، ۳۸/۶ برای لبنیات، ۷/۵ برای حبوبات) که در اینجا در ۲۵/۶ ضرب کرده و میزان پروتئین به صورت زیر به دست می آید:
 

T= میزان شاهد است (هر سانتی متر مکعب   با حدود ۰.۲ ازت ترکیب می شود.
X = میزان اسید مصرفی   در زمان تیتراسیون
 
Total Protein = N.P * 6.25
نیتروژن پروتئین به روش بیوره:
اساس این روش بر این واقعیت است که در یک محیط قلیایی املاح مس دو ظرفیتی (۲+ Cu) می توانند با بیوره کمپلکس رنگی ایجاد کند. چنین واکنشی با کلیه مواد پروتئینی که حداقل دارای دو پیوند پپتیدی هستند نیز قابل اجرا است.
این محلول عبارت است از محلول سولفات مس در یک قلیای قوی، که رنگی آبی- ارغوانی این محلول به اطلاعاتی در مورد عدد کئوردیناسیون کمپلکس بستگی دارد. بین Cu2+ و چهار اتم نیتروژن دو پپتید یک همسایگی و مجاورت بوجود می آید.
در شش لوله آزمایش، شش محلول ساخته و یک محلول استاندارد و یک محلول بلانک هم درست کرده که با محلول بلانک دستگاه اسپکتوفتومتر را صفر کرده و با محلول استاندارد جذب را اندازه گرفته و با شش محلول دیگر هم اعدادی به دست می اوریم که دستگاه یک خط راست را نشان می دهد و بعد محلول مورد آزمایش را طوری رقیق کرده که جذب آن درون این خط راست قرار گیرد و در نهایت جدب به دست آمده را در رفت ضرب کرده و میزان پروتئین به دست می آید.
پتونسی:
این آزمایش به منظور تعیین قدرت سرم های درمانی ضد سم در خنثی سازی سم صورت می گیرد. هنگامی که مقدار معینی سم استاندارد، با رقتهای مختلف سرم ضد سم مخلوط می شود و به حیوان تزریق می شود واکنش بدن حیوان در برابر سم با بعضی رقتهای ضد سم سرکوب می شود. بدین ترتیب حداقل مقدار سرم ضد سم برای خنثی کردن اثر سم تعیین می شود.
 
دیالیز توسط دستگاه یون زدا
حال به بررسی روش پیشنهادی برای دیالیز نمونه ها می پردازیم، دستگاهی که توسط دکتر زارع میرک ابادی طراحی و ساخته شده است توانایی دیالیز نمونه ها را در زمانی بسیار کوتاهتر نسبت به روش دیالیز سنتی (کیسه دیالیز) دارا می باشد و همچنین از نظر مصرف آب هم بسیار  مقرون به صرفه است و آب کمتری مصرف می کند.
اساس کار دستگاهی بدین صورت است که پس از مراحل نخست تصفیه و رسوب گیری هنگام خارج کردن نمک اضافی از نمونه ها به جای قرار دادن در کیسه های سلفونی و گذاشتن درون آب برای مدت ۴ تا ۵ روز می توان از دستگاه یون زدا برای دیالیز استفاده کرد.
دستگاه یون زدای آزمایشگاهی از اجزاء زیر ساخته شده است.
۱-    یک ظرف شیشه ای بزرگ به گنجایش ۱۰ لیتر جهت ریختن آب دیونیزه
۲-    یک ظرف شیشه ای کوچک به گنجایش ۵ لیتر جهت ریختن محلول سرم
۳-    صافی دیالیز (جهت تصفیه سرم از طریق انتقال یون)
۴-    دو عدد پمپ الکتریکی (جهت انتقال آب و سرم به درون صافی دیالیز)
۵-    شیرهای خروجی محلول سرم و آب
   اساس کار بدین صورت است که نمونه سرم را که به صورت جامد می باشد با قدری آب مخلوط کرده و به صورت مایع درون ظرف محتوی سرم ریخته و درون ظرف بزرگتر هم آب دیونیزه می ریزیم.
سپس پمپ ها را روشن کرده و جریان سرم از درون لایه های فیبری (فیلترها) عبور کرده و جریان آب هم از غشاء خارجی حرکت می نماید و فیلتر مربوطه اجازه عبور ذرات بسیار ریز را می دهد ونمک و املاح از آن خارج شده و به درون آب دیونیزه منتقل می شود و ذرات بزرگتر مثل پروتئین ها از غشاء مربوطه عبور نمی نماید و با این روش پس از چندین بار تعویض آب می توان محلول سرم را از وجود املاح و نمک ها عاری کرد.
حال به بررسی ومقایسه روش سنتی (کیسه دیالیز) با روش دستگاهی (دستگاه یون زدا) می پردازیم و نتایج را توسط داده های آماری مورد بررسی قرار می دهیم.
مدت زمان دیالیز:
مدت زمان دیالیز توسط دستگاه یون زدا در حدود ۴-۳ ساعت است و توسط کیسه دیالیز در حدود ۱۲۰-۹۹ ساعت می باشد.
میزان مصرف آب:

مصرف آب توسط دستگاه یون زدا در حدود ۸۰ لیتر است در حالی که توسط کیسه دیالیز در حدود ۲۰۰۰ لیتر می باشد. وزن خشک میزان پروتئین به روش کجدال، میزان پروتئین به روش بیوره هم در جدول زیر آمده است.

Reference:

۱-    Robert K. Scopes- 1977 – Protein Purification.
۲-    Trevor Palmer – 1980- Enzymes, Biochemistry, Biochemistry, Biotechnology, Clinical Chemistry.
۳-    D.S. Bendall – 1976 – Protein Electron Transfer.
۴-    World Health organization- Geneva, 1986 – AMMONIA.
۵-    Robert F. Allen, … -2001- ANNUAL Book of ASTM STANDARDS General methods and Instrumentation.
۶-    U.S. Pharmacopoeia National Formulary – 2000.
۷-    Internet: Ultrafree PF-60 concentrator – Device:
Millipore.com / publication. nsf/docs/pf412
۸-    Internet: Desalting: A treatment process.
۹-    Internet: O.K. Burros- The ABCs of Desalting
۱۰-internet: Larry Schwartz – Diafiltration . Pall life Sciences
E- mail at lab @ Pall.com or lab-UK @ pall.com
Visit on the web at www.pall.com  
۱۱- John.K.Hanry- 1986- Protein Determination Methodology- 23-27.
۱۲- Designation, ASTM: E 258 – 67 standard Test Method for Total Nitrogen in organic Materials by modified kjeldah/ Method.
۱۳. Internet : www. Membranes- amta. Org.
۱۴. Internet : www. Electrodialyses. Com
۱۵.Smith. A- the Enzyme Purification Laboratory- 1999- P.16-22
۱۶. Aucott, W.R- Desalting and purification- 2001- P.135- 140
۱۷. JohnH.Hash- 1975-Methods in Enzymology- P.535- 537
۱۸. J.C. BAILAR- 1953- INORGANIC Syntheses- P. 149-162
۱۹. Joseph NORDMANN- 1980- Qualitative testing and Inorganic chemistry. P.435- 441.
۲۰. Z. Vasilyera- A. Granovskaya- A.Taperara- 1974- laboratory- Manual for General and Inorganic chemistry.
۲۱. C.B. ANFINSEN, JR- M.L. ANSON- 1966- Asvances in Protein chemistry. Vol: 21-p.130- 133.
۲۲-DoDD Robinson- 1975- chemical Analysis- Vol:5-P.34-53.
۲۳. ROGER ASAMS – 1996- ORGANIC Reaction- Vol: 6-P.121-127.