فایل ورد کامل مقاله مقایسه کارایی روش PCR مستقیم با روش‌های میکروسکوپی و کشت in vitro در تشخیص دقیق لی‌شمانیوز پوستی

توجه : به همراه فایل word این محصول فایل پاورپوینت (PowerPoint) و اسلاید های آن به صورت هدیه ارائه خواهد شد

 فایل ورد کامل مقاله مقایسه کارایی روش PCR مستقیم با روش‌های میکروسکوپی و کشت in vitro در تشخیص دقیق لی‌شمانیوز پوستی دارای ۱۱ صفحه می باشد و دارای تنظیمات در microsoft word می باشد و آماده پرینت یا چاپ است

فایل ورد فایل ورد کامل مقاله مقایسه کارایی روش PCR مستقیم با روش‌های میکروسکوپی و کشت in vitro در تشخیص دقیق لی‌شمانیوز پوستی  کاملا فرمت بندی و تنظیم شده در استاندارد دانشگاه  و مراکز دولتی می باشد.

توجه : در صورت  مشاهده  بهم ریختگی احتمالی در متون زیر ،دلیل ان کپی کردن این مطالب از داخل فایل ورد می باشد و در فایل اصلی فایل ورد کامل مقاله مقایسه کارایی روش PCR مستقیم با روش‌های میکروسکوپی و کشت in vitro در تشخیص دقیق لی‌شمانیوز پوستی،به هیچ وجه بهم ریختگی وجود ندارد

---

بخشی از متن فایل ورد کامل مقاله مقایسه کارایی روش PCR مستقیم با روش‌های میکروسکوپی و کشت in vitro در تشخیص دقیق لی‌شمانیوز پوستی :

چکیده

زمینه و هدف: لیشمانیوز جلدی در ایران دارای کانون های متعددی است و طی دو دهه اخیر رو به فزونی بوده و کانونهای جدیـدی را بـهوجود آورده است. تشخیص این بیماری معمولا به روش میکروسکوپی صورت می گیـرد امـا ایـن روش از حـساسیت لازم برخـوردار نیـست و استفاده از روش های دیگری مانند PCR مورد توجه قرار گرفته است. در مطالعه حاضر، کارآیی روش PCR در مقایسه با روش میکروسـکوپی و کشت in vitro برای تشخیص مستقیم لیشمانیوز جلدی و شناسایی گونه انگل مورد ارزیابی قرار گرفته است.

مواد و روش کار: در این مطالعه از تعداد۷۳بیمار مشکوک به لیشمانیوز جلدی از روستاهای میرجاوه در فاصـله زمـانی زمـستان۱۳۸۴تـابهار ۱۳۸۵ نمونه برداری از زخم انجام شد و نمونه ها با سه روش میکروسکوپی، PCR و کشت در محیط NNN مورد آزمایش تشخیصی قـرار گرفتند. حساسیت و ویژگی روش ها بر اساس ماخذ Wassertheil-Smolle محاسبه گردید.
یافته ها: ۳۸/۴درصد از نمونه ها با روش میکروسکوپی،۵۵/۵درصد با روشPCRو۶۳/۱۵درصد با روش کشتNNNمثبت تـشخیصداده شدند. با روش PCR مستقیم گونه انگل در همه نمونه ها لیشمانیا ماژور (Leishmania major) تعیین شـد. حـساسیت و ویژگـی محاسـبه شده در مقایسه با روش کشت، برای روش میکروسکوپی بترتیب %۶۱ و %۱۰۰ و بـرای روش %۷۶PCR و %۷۳ بدسـت آمـد. حـساسیت هـر دو روش میکروسکوپی و PCR از روش کشت پائین تر بود اما حساسیت PCR در مقایسه با روش میکروسکوپی بالاتر بود.

نتیجه گیری: با توجه به حساسیت بالاتر روشPCRنسبت به روش میکروسکوپی و قابلیت آن در شناسایی گونه انگل لیشمانیا(همزمان بـاتـشخیص) و همچنـین حــساسیت چـشمگیر روش کــشت، پیـشنهاد مــی گـردد امکـان انجــام ایـن دو روش PCR) و کــشت) در کنـار آزمــایش میکروسکوپی حداقل در برخی مراکز تشخیصی فراهم گردد تا در مواردی که نیاز به تشخیص گونه لیشمانیا می باشد و هم در موارد مـشکوکی که لام میکروسکوپی منفی می شود مورد استفاده قرار گیرند. (مجله طبیب شرق، دوره نهم، شماره۳، پائیز۸۶، ص۱۸۱تا(۱۸۹
کلیدواژه ها: لیشمانیوز جلدی، تشخیص،PCR،In vitro

مقدمه

لیشمانیوز جلدی (سالک) یکی از بیماری های شایع پوسـتی است که در ۸۸ کـشور جهـان از جملـه ایـران آنـدمیک اسـت و حدود ۳۵۰ میلیون نفر در معرض ابتلا به بیماری هستند.((۱

برای تشخیص بیماری در آزمایشگاه هـای تـشخیص طبـی و مـــراکـز تشخیصی خصوصی و دولتی معموًلا از روش مستقیم

آدرس نویسنده مسئول: زاهدان ، دانشکده پزشکی

(میکروسکوپی) استفاده میگردد. این روش اگـر چـه ارزان و بـه راحتی در دسترس می باشد و نیازی به مواد و تجهیزات پیـشرفته و حساس ندارد، اما بـرای تـشخیص عامـل بیمـاری در زخمهـای جلــدی از حــساسیت کــافی برخــوردار نیــست. روش کــشت in vitro از حساسیت نسبتًا بالا و ویژگی مناسبی برخوردار است

۱۸۱ Email: afparma1 @yahoo.co.uk

ITS-I

اما این روش نیز محدودیتهای خاص خـود را دارد از جملـه ایـن موارد مـی تـوان بـه عـدم امکـان دسترسـی در همـه جـا، نیـاز بـه انکوبــاتور ۲۵ درجــه و محــیط کــشت، احتمــال آلــودگی هــای میکروبــی و قــارچی محــیط هــای کــشت و طــولانی بــودن دوره کشت اشاره کرد. حساسیت روش مستقیم و کشت به گونه انگل و طول دوره زخم سالک بستگی دارد. در بعضی منابع حساسیت ترکیبی این دو روش را بین ۵۰ تا ۷۰درصد ذکر نموده اند((۲
تکنیک PCR در سالهای اخیر هم برای تشخیص و هم برای تعیین گونه لیشمانیا استفاده شده است .(۳-۶) اعتقاد بـر ایـن اسـت که PCR برای تشخیص بیماری از حساسیت و ویژگـی بـالاتری نــسبت بــه روشــهای میکروســکوپی و بعــضی روش هــای دیگــر برخوردار اسـت. یکـی دیگـر از مزایـای روش PCR بـالا بـودن سرعت انجام آن نسبت به روش کشت است که زودتر بـه نتیجـه می رسد، اگر چـه روش میکروسـکوپی سـریعتر از PCR انجـام می شود. Belli و همکـاران (۱۹۹۸) حـساسیت و ویژگـی ۱۰۰

درصـــد را بـــرای روشPCRنـــسبت بـــه روش میکروســـکوپیگـزارش نمودنـد .(۷) همچنـین Aviles و همکـاران (۱۹۹۹) بـه ترتیب حساسیت و ویژگی ۹۲درصد و ۱۰۰درصد را برای PCR

در مقابــل روش میکروســکوپی بــا حــساسیت ۴۲درصــد، روش هیــستولوژی بــا حــساسیت ۳۳درصــد و تــشخیص ســرولوژیک

(IgG) با حـساسیت ۲۰درصـد گـزارش نمودنـد .(۸) در بررسـی دیگری بر روی تعداد ۱۱۹ نمونه بیوپـسی از زخـم هـای پوسـتی لیـشمانیوز آمریکـایی توسـط Rodrigues و همکـاران (۲۰۰۲)

نشان داده شد که حساسیت PCR بـرای تـشخیص تحـت جـنس Viania و تحت جنس Leishmania به ترتیـب ۹۵/۴درصـد و

۸۸/۲ درصد و ویژگی آن بـرای هـر دو زیـر جـنس۱۰۰ درصـد

بود(Gangneux.(9 و همکاران (۲۰۰۳) نیز حساسیت و ویژگی بــسیار بــالایی را بــا روش PCR نــسبت بــه روش هــای تــشخیص مــستقیم و کــشت در تــشخیص لیــشمانیوز گــزارش نمودنــد. (۱۰)

نتایج بعضی مطالعات نیز کیفیت بـالای روش PCR را بـا تردیـد مواجــه نمــوده اســت. بــرای مثــال در غربــالگری ســگهای آلــوده

توســـط Reithinger و همکـــاران (۲۰۰۳)، PCR حـــساسیت کمتری نسبت به روش الایزا (ELISA) برای تـشخیص لیـشمانیا دونوانی داشت .(۱۱)

بخش هایی از DNA لیشمانیا به عنوان مارکرهای تشخیصی و یــا تعیــین گونــه انگــل عامــل بیمــاری تــاکنون در کــشورهای مختلف از جمله ایران مورد استفاده قرار گرفتـه اسـت. از جملـه:

DNA رایبــوزومی (۱۲)(SSU rRNA)، تــوالی هــای تکــراری

(۱۲)(repetitive sequences)،DNA کینتوپلاسـتی (kDNA)
۱۴)و۱۳و۹و(۳-۵ و .(۱۵) تغییـــــرات بـــــازی در منـــــاطقی از

سکانس های DNA کینتوپلاسـتی در بـین گونـه هـای مختلـف انگل لیشمانیا شناسایی و از این تغییرات برای طراحی پرایمرهای اختصاصی و وابسته به گونـه اسـتفاده شـده اسـت. ایـن پرایمرهـا می توانند ضمن تشخیص مستقیم لیـشمانیا از نمونـه بیمـار، گونـه انگل لیشمانیا را نیز هم زمان افتراق دهند. هدف از انجـام مطالعـه حاضر ارزشـیابی روش PCR مـستقیم بـا اسـتفاده از پرایمرهـای فوق در مقایسه با روش های میکروسکوپی و کشت NNN برای تشخیص زخم های مشکوک به سالک و شناسایی مستقیم گونـه انگل عامل بیماری بود تا بر اساس نتـایج بدسـت آمـده بتـوان در خصوص جایگزینی روش PCR با روشهای دیگر و یا به عنـوان روشی مکمل در باره آن قضاوت نمود.

روش کار

این مطالعه مقایسه ای توصیفی در منطقه میل ۷۲ میرجاوه در فاصله زمانی زمستان ۱۳۸۴ و بهار ۱۳۸۵ انجام شـد. حجـم نمونـه بر اساس اطلاعات موجود بـرای متغیرهـای حـساسیت و ویژگـی روشهای مستقیم و PCR از ۳۱ نفـر تـا ۷۸ نفـر بدسـت آمـد کـه بالاترین حجم نمونه در نظر گرفته شد، البته نمونه گیری از تعداد

۵ نفر از بیماران میـسر نـشد و نهایتـا از تعـداد ۷۳ نفـر از بیمـاران دارای زخمهای مشکوک به سالک نمونه برداری شد. تمامی ۷۳

نفر بیمار از افراد سـاکن در روسـتاهای منطقـه میـل ۷۲ میرجـاوه بودند که از روستاهای مختلف و یا از عشایر بـصورت بیماریـابی شناسایی شدند و یا خـود بـه خانـه هـای بهداشـتی و درمانگاههـا

۱۸۲

Wassertheil-Smolle

مراجعه کرده بودند. نمونه ها با خـراش دادن کنـاره هـای متـورم زخم پس از ضـد عفـونی کـردن، تهیـه و در سـه بخـش، کـشت
NNN، PCR مستقیم و گسترش میکروسکوپی، مـورد اسـتفاده

قرار گرفتند.

کشتin vitro (در محیط :(NNNبخشی از نمونـه تهیـهشده از زخم مستقیمأ و در کنار شعله در فـاز مـایع محـیط NNN
وارد لوله می شد. لوله ها به انکوباتور ۲۵oC منتقل گردید و پس از آن بررســی میکروســکوپی محــیط هــای کــشت هــر ۲-۳ روز یکبار با مشاهده یک قطره از محـیط مـایع کـشت بـا درشـتنمایی
×۴۰ انجام می گردید و به محض مشاهده اشکال پروماسـتیگوت لیشمانیا، ۲ تا ۳ قطره از مایع روئی محیط کشت به محیط کـشت جدید پاساژ داده می شد. جهت از بین بردن آلـودگی میکروبـی محیط کـشت جنتامایـسین بـه میـزان ۵۰ -۱۰۰g/ml اسـتفاده می شد.

آزمایش میکروسکوپی: از هر نمونه بیمـار دو لام مـستقیمتهیه و پس از فیکس کردن گسترش ها با متانول، به روش گیمسا رنگ آمیزی گردیده و بـا عدسـی روغنـی مـورد مـشاهده دقیـق میکروســـکوپی قـــرار مـــی گرفـــت. حـــدا قـــل ۱۰۰ میـــدان میکروسکوپی از هر گسترش از قسمت های مختلف مشاهده می گردید.

اســتخراج DNA و انجــام :PCRبخـــش دیگـــری ازنمونه ها به لولـه هـای حـاوی محلـول بـافر PBS اسـتریل جهـت آزمایش PCR مستقیم منتقل مـی گردیـد و بـرای آمـاده سـازی نمونه به منظور اسـتخراج DNA، نمونـه هـا پـس از سـانتریفوژ و شستشو با بافر استریل رسـوب گیـری مـی شـد و تمـامی رسـوبها شماره گـذاری و تـا زمـان اسـتفاده در فریـزر -۲۰oC نگهـداری می گردید. برای استخراج DNA، کیت DNG-plus از شرکت ســیناژن تهــران تهیــه و مطــابق دســتورالعمل مــورد اســتفاده قــرار گرفت. DNA حاصل برای تشخیص و تعیین گونه انگل لیشمانیا مورد استفاده قرار می گرفت.

بــرای واکــنش PCR نیــز از کیــت شــرکت ســیناژن تهــران استفاده شد. برای آماده سازی مخلوط واکنش، به ازای هر نمونه مقـدار ۲۰l مخلـوط (PCR mix)PCR و ۱ واحـد (۰/۵l)Taq پلــی مــراز و DNA5l نمونــه مــورد نظــر داخــل یــک میکروتیوب ۰/۲ میلی لیتری ریخته و ۱ قطره روغن معدنی به هـر لوله افـزوده و در دسـتگاه PCR(ترموسـایکلر از نـوع بیـومترای فرانسه) قرار داده می شد. برای اطمینـان از صـحت انجـام PCR،

در هر نوبت PCR، یک نمونه کنتـرل مثبـت (از DNA لیـشمانیا ماژور موجود در کیت) و یک نمونه منفی (استفاده از آب مقطر بجای (DNA نیز همراه با نمونه ها استفاده می گردیـد. واکـنش
PCR نیز با شرایط موجود در راهنمای کیت انجام می گردید.

الکتروفوز و تهیه تصویر از محصول :PCRمقـدار۱۰

میکرولیتر از محصول هر واکـنش PCR در ژل آگـارز ۲درصـد در بافر۰/۵TAEدرصد به مدت ۸۰ دقیقه با ولتاژ ۱۰۰ میلی آمپر الکتروفورز گردید. پس از پایان الکتروفورز و رنـگ آمیـزی ژل با اتیدیوم برماید ( ۱mg در ۱۰۰ میلی لیتر بافر (TAE نتیجـه در دستگاه ژل گرب با اشعه UV مشاهده و عکسها در فلاپی ذخیره گردیــد. بــرای محاســبه انــدازه بانــدهای مــشاهده شــده در ژل از مارکر ۱kb ladder شرکت سـینا ژن اسـتفاده گردیـد. مـشاهده باندهای ۶۲۰bp نشاندهنده گونه لیشمانیا ماژور، ۸۰۰bp معرف گونه لیشمانیا تروپیکا و عدم مـشاهده بانـد بـه منزلـه منفـی بـودن نمونه تلقی می گردد. حساسیت و ویژگی روشها بر اساس مأخذ

محاسبه گردید.((۱۶

نمونه بـرداری از بیمـاران بـا کـسب رضـایت آنـان و مطـابق روش معمول یک بار انجام گردید. نتایج آزمایش نمونه بیمـاران جهت پیگیری و درمان به آنها اعلام گردیـد، ضـمنا در تجزیـه و تحلیل داده ها و گزارش نتایج نامی از بیماران ثبت نگردید.

یافته ها

از مجموع ۷۳ بیمار۳۰ نفر مذکر و ۴۳ نفر مونث بین سـنین ۲

ماه تا ۵۸ سال بودند و میانگین سنی آنان ۱۴/۶ سال بـود. ۵۳ نفـر

۱۸۳

از این بیماران ایرانی و ۲۰ نفر غیـر ایرانـی (افغـان) بودنـد. نتـایج آزمایش میکروسکوپی در ۲۸ مورد از ۷۳ بیمار (%۳۸/۴) و نتایج کشت نمونه ها در محـیط NNN در ۴۶ مـورد (%۶۳/۱۵) مثبـت شد. آزمایش PCR بر روی ۶۳ نمونه از نمونـه هـای فـوق انجـام گردید که ۳۵ مورد (%۵۵/۵) مثبت گردیـد. PCR مـستقیم روی

۱۰ نمونه دیگر به دلیل عدم تهیه نمونه آنهـا بـرای PCR مـستقیم انجام نشد. بـه منظـور مقایـسه ایـن ۳ روش در تـشخیص بیمـاری لیشمانیوز، روش کشت NNN بعنوان استاندارد طلایـی ( Gold(standard در نظر گرفته شد (۱۷) و دو روش دیگر نسبت به این روش مورد سنجش قرار گرفت. حـساسیت و ویژگـی بـا حـدود اطمینان %۹۵، برای روش میکروسـکوپی بترتیـب((%۶۱-۰/۱۴ و (%۱۰۰-۰/۰۶) بدست آمد (جدول (۱

جدول شماره :۱ مقایسه آزمـایش میکروسـکوپی بـا روش کـشت برای تشخیص لیشمانیوز جلدی در میرجاوه، ۱۳۸۴
کشت (NNN)
مثبت منفی جمع
میکروسکوپی مثبت (a) 28 (b) 0 28
منفی (c)18 (d) 27 45
جمع ۴۶ ۲۷ ۷۳

Sensitivity ( Se) = a ÷ (a+c) = 28 ÷ (۲۸+۱۸) = %۶۱ – ۰/۱۴ Specificity (Sp) = d ÷ (b+d) = 27 ÷ (۰ +۲۷) = %۱۰۰ – ۰/۰۶

ارزش اخباری مثبـت و ارزش اخبـاری منفـی نیـز بـرای ایـن روش بترتیـــب ۱ و ۰/۶ حاصـــل شـــد. در مـــورد روش PCR

حساسیت و ویژگی بترتیب برابر ( (%۷۶-۰/۱۶ و (%۷۳-۰/۱۹) و

ارزش اخبــاری مثبــت و منفــی بترتیــب ۰/۸۰ و ۰/۶۸ محاســبه گردید. (جدول شماره (۲

جدول شماره :۲ مقایسه روش PCR با روش کشت برای تشخیص لیشمانیوز جلدی در میرجاوه، (۱۳۸۴)
کشت (NNN)
مثبت منفی جمع
PCR مثبت ۲۸ ۷ ۳۵
منفی ۹ ۱۹ ۲۸

جمع ۳۷ ۲۶ ۶۳

Se = 28 ÷ (۲۸+۹) = %۷۶ – ۰/۱۶

Sp = 19 ÷ (۷+۱۹) = %۷۳ – ۰/۱۹

۱۸۴

بحث

ایـــن مطالعـــه نـــشان داد کـــه حـــساسیت هـــر دو روش میکروسکوپی و PCR از روش کشت پائین تر اسـت امـا روش

PCR از نظــر حــساسیت نــسبت بــه روش میکروســکوپی برتــری دارد. بعلاوه اینکه مزیت شناسایی گونه انگـل نیـز اختـصاص بـه روش PCR دارد. گونه انگل قبلا در این منطقه شناسـایی نـشده بود و نظرات اغلب بر اسـاس علائـم بـالینی بـود کـه مـواردی را بعنوان سالک شهری و بخشی را بعنوان سالک روسـتایی معرفـی می کردند. گونـه انگـل شناسـایی شـده بـا روش PCR لیـشمانیا ماژور (Leishmania major) تشخیص داده شـد و ایـن خـود دلیلی است بر اینکه بیماری در این منطقه از نوع روستایی است.

ارزشیابی و مقایسه روشهای تشخیـصی لیـشمانیوز از اهمیـت ویژه ای برخوردار است و تصمیم گیری در خصوص اینکـه چـه روشی برای چه هدفی توصیه گردد هنوز نیازمند اطلاعات دقیـق پژوهــــشی مــــی باشــــد. در ایــــن مطالعــــه ســــه روش PCR،

میکروســکوپی و کــشت از نظــر تشخیــصی مــورد مقایــسه قــرار گرفتند.

پــائین تــرین حــساسیت (%۶۱) بــرای روش میکروســکوپی بدســت آمــد. اگرچــه ویژگــی روش میکروســکوپی در مطالعــه حاضر ۱۰۰درصد بود اما با توجه بـه پـائین بـودن حـساسیت آن، ایــن روش بــرای تــشخیص بیمــاری لیــشمانیوز از اعتمــاد کــافی برخوردار نیست. سایر مطالعات نیز حساسیت پائینی را بـرای ایـن روش گــزارش نمودنــد، بعنــوان مثــال در مطالعــه Aviles و

همکاران (۸)، حساسیت میکروسکوپی ۴۲درصد بـود. در مطالعـه ای در ترکیه، Culha و همکاران تعداد ۲۵ نمونه را مورد مقایسه قرار دادند که با روش میکروسکوپی ۶۸ درصد از آنها تـشخیص داده شد و در مقایسه با مطالعه حاضر حساسیت بـالاتری را نـشان داد، البته به نظر می رسد تعداد نمونه در مطالعه فـوق ۲۵) مـورد)

جهت مقایـسه تحلیلـی کـافی نیـست و از طرفـی، بیمـاران مـورد مطالعه آنها به لیشمانیوز جلدی نوع شهری مبتلا بودند کـه عامـل آن لیشمانیا تروپیکا است و این گونـه از انگـل معمـولأ بـه میـزان

فراوانتری در زخم نسبت به لیشمانیا ماژور (عامل نـوع روسـتایی)

وجود دارد. (۱۸)برای روش PCR در مطالعه حاضـر حـساسیت و ویژگــی بترتیــب %۷۶ و %۷۳ نــسبت بــه روش کــشت in vitro
بدست آمد. در مطالعات دیگر نتایج مشابه یا با کمی تفاوت ارائه شــده و گــاهی حــساسیت و ویژگــی بــالاتری را نیــز گــزارش نمــوده انــد.(Oliveira(3-10 و همکــاران (۱۹)(۲۰۰۵) در یــک ارزشیابی PCR برای تشخیص لیشمانیوز مخاطی ۳۴ مـورد از ۳۵

مورد (%۹۱/۹۷) را تشخیص دادنـد. Al-Javabreh و همکـاران

(۲۰۰۶) بــــا اســــتفاده از قطعــــه ITS1 از DNA رایبــــوزومی، حساسیت ۸۷ درصـد و ویژگـی ۱۰۰ درصـد بـرای روش PCR

خــود گــزارش نمودنــد .(۲۰) همچنــین Marques و همکــاران

(۲۱)(۲۰۰۶) در مطالعـــه مقایـــسه روش PCR (قطعـــه ثابـــت از

(kDNA بــا روش میکروســکوپی و تــست جلــدی مونتــه نگــرو

(Montenegro skin test) بـرای تـشخیص لیـشمانیوز جلـدی آمریکایی، دریافتنـد کـه روش PCR مـی توانـد بعنـوان روشـی جایگزین برای تشخیص این نوع بیماری بخصوص برای مواردی که با تست جلدی و مونته نگر و منفی تـشخیص داده مـی شـوند بکار رود.

البته ذکر این نکته لازم است که شاید مقایـسه نتـایج بدسـت آمده با نتایج مطالعات دیگران به دلایلی در همه مـوارد از دقـت و استدلال کافی برخوردار نباشد اول اینکه در بعـضی مطالعـات نوع بیماری در منطقه آنـدمیک مـورد مطالعـه از نـوع لیـشمانیوز جلــدی شــهری و در بعــضی مطالعــات از نــوع روســتایی اســت و اصولأ تعداد انگل (لیشمانیا تروپیکا) در زخـم هـای نـوع شـهری بیشتر از تعداد انگل (لیشمانیا ماژور) در زخم های نوع روسـتایی است. () دوم اینکه تعداد انگل موجود در زخم لیشمانیوز معمـولأ با پیشرفت دوره زخم کاهش پیدا می کند (۷)، بنابراین این مـسئله که در زمان نمونه برداری زخمها در چه مرحله ای قرار داشته اند محل سـوال اسـت و فراوانـی انگـل در نمونـه برداشـت شـده در بیماران متفاوت است و این نیز می توانـد منـشأ تفـاوت در نتـایج

آزمایشات در مطالعات مختلف باشد. دلیـل سـوم ایـن اسـت کـه تفاوت در روش های خالص سـازی (۲۲)DNA و همچنـین نـوع ژن یا قطعه DNA مورد هدف که در مطالعات مختلـف اسـتفاده می شوند نیز می تواند از عوامل موثر بر نتایج از جمله حـساسیت و ویژگی روش ها باشد.

به نظر مـی رسـد حـساسیت و ویژگـی مطالعـه حاضـر بـرای

PCR پائین تر از حد انتظار باشـد. دلیـل آن مـی توانـد برخـی از موارد فوق باشد. شاید یک دلیل آن استفاده از نـوع کیـت مـورد اســتفاده (DNG-plus) بــرای استحــصال DNA از نمونــه هــای مستقیم در این مطالعه باشد. لذا مقایسه روش کیت مزبور با سـایر روش های استحـصال DNA بخـصوص روش فنـل – کلروفـرم خالی از فایده نیست. البته این بحث در مقایسه با بعضی مطالعاتی که فبلاً اشاره شد مطرح می گردد ولی مسلم اینست که بر اساس نتایج این مطالعـه روش PCR نـسبت بـه روش میکروسـکوپی از حــساسیت بــسیار بــالاتری برخــوردار اســت. از طــرف دیگــر بــا استفاده از پرایمرهـای اختـصاصی مـی تـوان همزمـان عـلاوه بـر تشخیص بیماری سالک، گونـه انگـل عامـل بیمـاری و در نتیجـه نوع سالک را نیز شناسایی نمود.

بد نیست به این موضوع نیز اشاره گردد که اگر چـه تـاکنون روش کشت in vitro (در محیط (NNN در مطالعـات مختلـف از جمله مطالعه حاضر بعنوان استاندارد طلایی مورداسـتفاده قـرار گرفته است، با ایـن حـال بعـضی اعتقـاد دارنـد کـه حـساسیت و ویژگی روش PCR بالاتر از روش کشت است و برتـری آن در حال محرز شدن است، به گونه ای که ممکن است بتدریج جـای روش کــشت را بعنــوان اســتاندارد طلایــی بگیــرد .(۲۳) هــر چنــد مطالعاتی نیز حاکی از این است که PCR به تنهـایی نمـی توانـد استاندارد طلایی برای تشخیص باشد.((۲۴

علیرغم نتایج بـسیار بـا ارزش حاصـل از کـاربرد روش هـای مولکولی برای تشخیص لیشمانیوز، بایـد اذعـان نمـود کـه هـیچ یک از روش های تشخیصی دیگـر از جملـه PCR و کـشت بـه

۱۸۵

ارزانی و سـادگی روش میکروسـکوپی نیـست. بـر اسـاس نتـایج بدست آمده در این مطالعه، این نکته تأکید می گـردد کـه بـرای هر گونه تصمیم گیری بخصوص درمـان بیمـاران، بـه پاسـخهای منفی گـسترش میکروسـکوپی نمـی تـوان اکتفـا نمـود و لـذا در مراکــزی کــه مــوارد زیــادی بــرای تــشخیص، درمــان و پیگیــری سالک مراجعـه مـی نماینـد، راه انـدازی روش PCR و همچنـین روش کــشت NNN بعنــوان روشــهای مکمــل بــالاخص بــرای گسترش های منفی و همچنـین بـرای تعیـین گونـه انگـل (کـه از امتیازات روش PCR اختصاصی بکار رفته در این مطالعه اسـت)
قابل توجیه می باشد.

سپاسگزاری

هزینه انجام این مطالعـه توسـط دانـشگاههای علـوم پزشـکی زاهدان و کرمان در قالب طرح تحقیقاتی بـین دانـشگاهی تـأمین

گردیده است. ضمنأ، نویسندگان بر خـود لازم مـی داننـد کـه از همکــاری صــمیمانه مــسئولین مرکــز بهداشــت اســتان سیــستان و بلوچــستان و مرکــز بهداشــت شهرســتان زاهــدان تــشکر نماینــد.

همچنین از کلیه کارکنـان مراکـز و خانـه هـای بهداشـت شـهر و روستاهای میرجـاوه بـالاخص آقایـان فـیض محمـد شـنبه زهـی، احمد کردی، کیومرث ریگی، امان ا; ریگی، محمد فیروزی و خــانم مهنــاز نــارویی و همچنــین مــردم عزیــز روســتاهای منطقــه بخصوص روسـتاهای میـل ۷۲ بـه واسـطه همکاریـشان صـمیمانه قدردانی و تشکر می گردد.

References

WHO. The leishmaniases and Leishmania/HIV co-infections . WHO, Fact sheet N 116, 1.
۲۰۰۰. Available from http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs116/en/print .html.
Mandell GL, Bennett JE, Dolin. Principles and practice of infectious diseases . 5th ed. 2.
Churchill Livingstone, 2000; 2838-2839.
Noyes HA, Reyburn H, Bailey JW, et al. A nested-PCR-based schizodeme method for 3.
identifying Leishmaniakinetoplastminicircle classes directly from clinical samples and
its application to the study of the epidemiology of Leishmaniatropica in Pakistan. J Clin
Microbiol 1998; 36(10):2877-2881
Mahboudi F, Abolhassan M, Yaran M, et al . Identification and differentiation of Iranian 4.
Leishmania species by PCR amplification of kDNA. Scand J Infect Dis 2001; 33(8):596-
۵۹۸.
Safaei A, Motazedian MH, VaseiM . Polymerase chain reaction for diagnosis of cutaneous 5.
leishmaniasis in histologically positive, suspicious and negative skin biopsies.
Dermatology 2002; 205(1):18-24.
Rodriguez-BonfanteC ,Bonfante-Garrido R, Grimaldi G Jr, et al . Genotypically distinct 6.
Leishmaniacolombiensis isolates from Venezuela cause both cutaneous and visceral
leishmaniasis in humans. Infect Genet Evol. 2003; 3(2):119-124.
۱۸۶

ناراکمهویدلاوفنمهب ; ابمیقتسمPCRشورهسیاقم

۷ Belli A, Rodriguez B, Aviles H, et al. Simplified polymerase chain reaction detection of new world Leishmania in clinical specimens of cutaneous leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg 1998; 58(1):102-109.
۸. Aviles H, Belli A, Armijos R, et al. PCR detection and identification of Leishmania parasites in clinical specimens in Ecuador: a comparison with classical diagnostic methods. J Parasitol 1999; 85(2):181-187.
۹. Rodrigues EH, Felinto de Brito ME, Mendonca MG, et al. Evaluation of PCR for diagnosis of american cutaneous leishmaniasis in an area of endemicity in northeastern Brazil. J ClinMicrobiol 2002; 40 (10) :3572-3576.
۱۰. Gangneux JP, Menotti J, Lorenzo F, et al. Prospective value of PCR amplification and sequencing for diagnosis and typing of old world Leishmania infections in an area of nonendemicity. J ClinMicrobiol 2003; 41(4):1419-1422.
۱۱. Reithinger R, Espinoza JC, Courtenay O, et al. Evaluation of PCR as a diagnostic mass-screening tool to detect Leishmania (Viannia) spp. in domestic dogs (Canisfamiliaris).J ClinMicrobiol 2003; 41(4):1486-1493.

۱۲ Van Eys GJ, Schoone GJ, Kroon NC, et al. Sequence analysis of small subunit ribosomal RNA genes and its use for detection and identification of Leishmania parasites. MolBiochemParasitol 1992; 51:133-142.
۱۳. Alvar J, Molina R, San Andres M, et al. Canine leishmaniasis clinical, parasitological, and entomological follow-up after chemotherapy. Ann Trop Med Parasitol 1994; 88:371-378.

۱۴ Rodgers MR, Popper SJ, Wirth DF. Amplification of kinetoplast DNA as a tool in the detection and diagnosis of Leishmania. ExpParasitol 1990; 71(3):267-275.
۱۵. Schonian G, Nasereddin A, Dinse N, et al. PCR diagnosis and characterization of Leishmania in local and imported clinical samples. DiagnMicrobiol Infect Dis 2003; 47(1):349-358.