فایل ورد کامل مقاله بررسی پاسخ مورفین در مدل حیوانی تک‌یاخته‌ای Paramecium caudatum

توجه : به همراه فایل word این محصول فایل پاورپوینت (PowerPoint) و اسلاید های آن به صورت هدیه ارائه خواهد شد

 فایل ورد کامل مقاله بررسی پاسخ مورفین در مدل حیوانی تک‌یاخته‌ای Paramecium caudatum دارای ۱۴ صفحه می باشد و دارای تنظیمات در microsoft word می باشد و آماده پرینت یا چاپ است

فایل ورد فایل ورد کامل مقاله بررسی پاسخ مورفین در مدل حیوانی تک‌یاخته‌ای Paramecium caudatum  کاملا فرمت بندی و تنظیم شده در استاندارد دانشگاه  و مراکز دولتی می باشد.

توجه : در صورت  مشاهده  بهم ریختگی احتمالی در متون زیر ،دلیل ان کپی کردن این مطالب از داخل فایل ورد می باشد و در فایل اصلی فایل ورد کامل مقاله بررسی پاسخ مورفین در مدل حیوانی تک‌یاخته‌ای Paramecium caudatum،به هیچ وجه بهم ریختگی وجود ندارد

---

بخشی از متن فایل ورد کامل مقاله بررسی پاسخ مورفین در مدل حیوانی تک‌یاخته‌ای Paramecium caudatum :

چکیده

مقدمه: پاسخ مرفین و نقش عوامل مختلف به ویژه نیتریک اکساید(NO)بر بیان آن در مهره داران مطالعه شده است، اما شواهد کافی برای ایـن مسـاله در بـی مهرگـانپست وجود ندارد. در این پژوهش نقش NO در بیان قدرت مرفین در Paramecium caudatum برای اولین بار مورد مطالعه قرار گرفت.
روش ها: نمونه حیوانی پس از جداسازی از محیط طبیعی و تائید گونه در آزمایشـگاه پـرورش داده شـد . یـک میلـی لیتـر از محـیط کشـت خـالص بـه لام سـلول شـمارSedgwick-Rafter اضافه و دارو در حجم یک l تلقیح شد. اثر تلقیح مرفین (۱-۶۰g/l) طی فواصل زمانی (۰ -۱۸۰ sec) گزارش گردید. ال- آرژینین (۱-۸g/l)، پیش ساز NO، قبل از مرفین (۲g/l) تلقیح و آنزیم مولد NO با پیش تجویز L-NAME مهار شد. همچنین بـرای نشـان دادن دخالـت گیرنـده هـای اپیوئیـدی در اثـرات سیگنالینگ مرفین از Naloxone استفاده شد. فعالیت سیستم NO با NADPH-diaphorase مورد بررسی قرار گرفت. در نمونه های شاهد آب مقطر اضافه شد.

یافته ها: سلول هایP. caudatumتحت تاثیر مرفین مجتمع شدند و بیشترین حالت تجمع نیز تحت دوز نسبتاً پائین مرفین(۲g/l)مشاهده شد. ال- آرژینـین اثـرمثبت بر این فرایند داشت (p<0.001) در حالیکه پیش تجویز L-NAME این اثرات را متوقف کرد. Naloxone نیز تاثیر مهاری نشان داد. تغییر فعالیت آنزیم نیتریـک اکسـاید سینتاز (Nitric Oxide Synthase) با NADPH-diaphorase در P. caudatum نشان داده شد.

نتیجه گیری: یکی از اثرات داروئی مرفین در مدل حیوانی تک یاخته ای بروز تجمع سلولی است و نتایج فوق نشان مـی دهـ د کـه سیسـتمNOبـا سیسـتم اپیوئیـدی درP. caudatum در این راستا تداخل دارد. از طرف دیگر با توجه به پاسخ تقویتی ال-آرژینین بر دوز موثر مرفین، این یافته می تواند در راستای کـاهش اثـرات جـانبی مـرفین (در بیماران تحت درمان با مرفین) و مسائل مربوط به اقتصاد دارویی ارزشمند باشد.

واژههای کلیدی: P. caudatum، قدرت مرفین، نیتریک اکساید

مقدمه

نیتریک اکساید (Nitric Oxide) مولکول کوچک و گازی شکل است که در انجام بسیاری از فرایندها مشارکت می کنـد. اهمیت این عامل در القای اثرات مرفین در مدل هـای حیـوانی نشان داده شده است .[۱۲] مسئول بیوسنتز ایـن عامـل آنـزیم

* نویسنده مسئول مکاتبات: karami@shahed.ac.ir
وبگاه مجله: www.phypha.ir/ppj

نیتریک اکساید سینتاز (Nitric Oxid Synthase) است اولین بار در ماکروفاژها و سلول های اندوتلیال پستانداران شـرح داده

شـد و امـروزه لااقـل ســه ایزوفـرم اصـلی

NOS3) از آن در پستانداران معرفی شده است .[۳,۱۷] امـا در رابطه با این مولکول سیگنال و نقش آن در بروز اثرات داروئـی مرفین در جانوران بی مهره شـواهد کـافی در دسـت نیسـت. از جمله معدود شواهد موجود می توان به تـأثیر مـرفین در تولیـد NO درAscarissuum (نوعی نماتد) اشـاره کـرد [۲۵] و نیـز مطالعــاتی بــرای معرفــی رونــد انتقــال ســیگنال مــرفین و

۳۱۹ ۳۱۹

– اندورفین در تعدادی حیـوان تـک یاختـه ای مـژه دار ماننـد آبگیرهای کم عمق و آبگاه ها جمـع آوری و بـا کشـت طبیعـی
Paramecium,Stentor و Tetrahymena انجــام گرفتــه (خیسانده یونجه) در آزمایشگاه نگه داری و تائید گونـه ای شـد
است که برهمکنش این مواد را با رسپتورهای اپیوئیـدی و –G .[10,11]
پروتئین ها در سطح این مـدل هـای سـلولی نشـان مـی دهـد به منظور کشت و پرورش حیوان در آزمایشگاه ابتدا مقداری
.[۱۵,۱۶] اما از آنجا کـه شـناخت مولکـول هـای هـدف مـواد یونجه خشک ۵) گرم) را در ۵۰۰ میلـی لیتـر آب بـه مـدت ۱۰
اپیوئیدی مانند مرفین در سطح سلولی دارای کاربردهای بسـیار دقیقه جوشانده و مخلوط را پس ازخنک شـدن در شیشـه درب
مهم فارماکولوژیک است که به گستردگی عملی استفاده داروئی دار در دمای ۴ °C (به عنوان محیط غذایی پایـه) نگـه داشـت .
این مواد در حیوانات و انسان مـی انجامـد هرگونـه مطالعـه در برای تهیه محیط کشت طبیعـی بـه ازای هـر ۲۰۰ ml آب ۲۰
ســطح ســلولی و مولکــولی باعــث روشــن تــر شــدن جریانــات میلی لیتر از محیط مغذی یونجه اضافه شد، سپس تـک یاختـه
بیوشیمیایی مداخله کننده در بیان تاثیرات داروئـی ایـن مـواد و مورد نظر با کمک پیپت به این محیط تلقیح گردیـد. در نهایـت
صرفه بهداشتی-اقتصادی خواهد شد. با گسـتردگی عمـل NO هر ۷۲ ساعت یک بار، پاساژ کشـت تـک یاختـه مـورد نظـر از
در سلسله جانوری، دور از انتظار نخواهد بود اگر عامل مذکور در محیط قبلی به محیط تازه انجام گرفت و این عمل تا آنجـا کـه
تک یاختگان نیز عملکرد مؤثر و مشـابه بـا آنچـه در حیوانـات کشتنسبتاً خالصی از تک یاخته مورد نظر تهیـه شـود، تکـرا ر
عــالی تــر و حتــی انســان گــزارش گردیــده اســت در تمــامی گردید. سرانجام فرایند کشت دادن درمحیط مصنوعی بـه اجـرا
فرآیندهای حیاتی از جمله اثرات داروئی مرفین داشته باشد، زیرا درآمد .[۱۱]
در P. caudatum بیوملکول های هـدف NO ماننـد گوانیلیـل برای تهیه محیط کشت مصنوعی ۲ g پودر مخمـر در یـک
سیکلاز [۱۳]، کانال پتاسیم و کانال کلسیمی دریچه دار وابسته لیتر آب مقطر حل و حاصل پس از اتوکلاو در دمای ۴ °C نگه
به ولتاژ [۹,۱۹,۲۰,۲۲]، کالمودولین [۴] (یکی از پروتئین هـای داری شد. به منظور تهیه محیط کشت حاوی تک یاختـه مـورد
لازم بــرای فعالیــت آنــزیم (NOS و یــک پــروتئین بــا وزن نظر، به ازای هـر ۶۰ ml از ایـن محـیط کـه در پتـری دیـش
[۱۴]۱۵۵kDa که بسیار شبیه به آنزیم NOS1 پستانداران مـی استریل اضافه میشد، تعدادی میکروارگانیسم از محـیط کشـت
باشد به دست آمده است. قدرت دارویی((Drug Potency مواد طبیعی به کمک پیپت به این محیط تلقیح شـد. در نهایـت هـر
مخدر مانند مرفین یکی از مشخصه های بارز فارماکودینامیـک ۷۲ ساعت یک بار، پاساژ کشت از محیط قبلی به محـیط تـازه،
برای معرفی پاسخ موجود زنده به ایـن مـواد اسـت [۱۰,۲۱] در انجام شد و این عمل تا زمـانی کـه مطالعـات رفتـاری و سـیتو
حالیکه ساز و کارهای سیتو شـیمیایی ایـن جریـان بـه وضـوح شیمیایی به پایان برسد، ادامه پیدا کرد.
تبیین نشده است تنها به دخالت بعضـی مولکـول هـا از جملـه pH بهینـــه بـــرای رشـــد ســـلول هـــای P.caudatum
NO در این روند استناد شده است همچنانکه پاسخ ضـد دردی درمحدوده۶/۸±۰/۲ میباشد. برای تنظیم pH دراین محـدوده
مواد اپیوئیدی (به ویژه مرفین) و نیز جریانات یادگیری و حافظه از محلولهای استیک اسید و سود ۰/۱ نرمال استفاده شد .[۱۱]
را در مهــره داران بــه سیســتم نتتریــک ارژیــک نیــز منتســب همچنین دمای بهینه برای رشد سلول هـای P.caudatum
مــی داننــد .[۵,۱۲,۱۸,۲۴] بنــابراین مطالعــه پاســخ مــرفین در در محدوده ۳۲±۲ درجه سانتیگراد میباشد [۱۴]، جهت تنظـیم
بی مهرگان، به ویژه مدل های حیـوانی تـک یاختـه ای ماننـد دما، محیط کشت حاوی P.caudatum در شـرایط آزمایشـگاه
Paramecium caudatum می تواند بـه شـناخت پایـه هـای تحت دمای ۳۲±۲ درجه سانتیگراد نگـه داری شـد و مطالعـات
زیستی اثرات مواد مخدر و در راس آن ها مرفین بیانجامد. رفتاری در همین محدوده دمایی به انجام رسید.
موادوروشها مــواد مــورد اســتفاده عبارتنــد از: Morphine sulphate
(خریــداری شــده ازشــرکت تمــاد بــا مجــوز رســمی از وزارت
بهداشـــت)، L-arginine (از شـــرکت(Sigma-USA،-NG
P.caudatum از ایستگاههای آب شیرین موقـت، ازجملـه nitro-L-Arginine methyl ester) L-NAME از شرکت

۰۲۳ ۳۲۰

تاثیر NO بر قدرت مرفین در Paramecium caudatum

(Biochemical Research Inc.,-USA و Naloxonehydrocloride (از شرکت تولید دارو).

برای تلقیح دارو به محیط کشت نمونه تک یاختهای و تهیه دوزهای مشخصی از داروها، این مواد با ترازوی دقیق تـوزین و در آب مقطر به صورت محلـول تهیـه گردیـده و در نهایـت در حجم یک میکرولیتر توسط سرنگ همیلتون تلقیح شد. قبـل از هر بار تلقیح داروئی، ابتدا ۱ میلی لیتر از محـیط کشـت حـاوی سلول های P.caudatum به درون لام استاندارد و مخصـوص شـمارش سـدویک-رافتـر (Sedgwick-Rafter CountingChamber) انتقــال داده شــد، طوریکــه تــراکم ســلولهــای P.caudatum در درون لام برابـــر بـــا ۲۵۰paramecia/ml

۲۶۰۰± و دمای محیط در زمان مطالعات رفتاری ۳۲±۲ درجـه سانتیگراد و pH=6/8±۰/۲باشد .[۱۴] قبل از تلقیح ابتدا یک دقیقه فرصت داده شد تا سلول های P.caudatum بـا مکـان جدید (لام سدویک) سازگار شوند. سـپس مـواد فـوقالـذکر در نقطه مشخصی از لام سدویک (که در زیـر لنـز ۴ (تحـت (۴X میکروسکوپ نوری تنظیم شده بود) تلقیح و رفتار سـلول هـای P.caudatum در نقطه تلقـیح از طریـق لنـز ۴ میکروسـکوپ نوری (۴X) مشاهده و بررسی گردید.

به منظور بررسی رفتار جانور تـک یاختـه ای پـس از تلقـیح رفتــار ایــن حیــوان از طریــق شــمارش تعــداد ســلول هــای P.caudatum در نقطه تلقـیحدرون لاماسـتانداردسـدویک-رافتــر طــی فواصــل زمــانی ۰، ۵ ، ۱۵، ۳۰، ۶۰ ، ۱۲۰ و ۱۸۰ ازطریق میدان دید لنز ۴ (تحت (۴X میکروسکوپ نـوری مورد مطالعه قرار گرفت و محاسبات مربوطه ثبت گردیـد، لازم به ذکر است که تزریق هر دوز مشخص از دارو یـا مـواد مـورد

نظر حداقل ۵ بار تکرار شد.

در کنار مطالعات رفتاری و جمـع آوری و تجزیـه و تحلیـل دادههــا مطالعــات ســیتو شــیمیایی بــا روش سیتوشــیمیایی [۱,۲۳] NADPH-diaphorase برای بررسی تداخل سیسـتم NO با مرفین، انجام شد:

به منظور اجرای مراحل تکنیـک NADPH-diaphorase هر نمونه (Sample) از سلول های P.caudatum را کهقـبلاً تحت تلقیح دوزهای مشخصی از مواد قرار گرفته بودند، بر روی سطح لام های تمیـزی منتقـل، دقـایقی در هـوای آزمایشـگاه خشک و فیکس گردید و سپس بر روی لامهای فـیکس شـده،

عملیات زیر، مرحله به مرحله و بلافاصله به اجرا در آمد.

-۱ آبدهی: با شستشو در درجات نزولـی الکـل از ۹۶° تـا ۵۰° هریک به مدت ۳ ثانیه و سپس شستشو در آب بـه مـدت

۱ ثانیه.

-۲ رنگ آمیزی اختصاصی: برای رنگ آمیـزی اختصاصـی

سیتوشیمیایی NADPH-d بر روی هر نمونه لام فیکس شـده

به نسبت مساوی از محلول هایNADPH 1mg/ml) در بافر
فســـفات)، و ۰۲ mg/ml از N.B.T (Nitro Blue

Tetrazolium) در بافر فسفات اضافه شـد (بـافر فسـفات بـه عنوان حلال تحت pH= 7 استفاده شد). به ایـن ترکیـب چنـد قطره Triton-x-100 (به عنوان Detergent مواد و رنگ های اضافی) که به کمک بافر رقیق شده بود ( ( %۳ اضافه گردید، و هر لام به مدت چند ثانیه تکان داده شد تا برای مراحـل بعـدی آماده شود.

-۳ انکوباسیون تحت دمـای :۴۰°C هـر یـک از لام هـای فیکس شده که با روش فوق تحـت رنـگ آمیـزی اختصاصـی سیتوشـیمیایی NADPH-d واقـع شــد، در بنمـاری ۴۰°C بــه مدت ۳۰ دقیقه نگه داری گردید. سپس نمونه از بنماری خـارج شدهجهت، شستشوی رنگ، نمونه از آب مقطر سریعاً عبور داده و برای مرحله بعد آماده شد

-۴ آب گیری با درجات افزایشی الکل از ۵۰° تا ۹۶° هـر یک به مدت ۳ ثانیه.

-۵ شفاف سازی با دو تعویض گزیلل هریک بـه مـدت ۱۵ ثانیه.

-۶ چسباندن :(Mounting) در نهایـت هـر نمونـه لام بـه کمــک چســب انــتلان (Entellan) خریــداری شــده ازشــرکت Merck چسبانده شد.
تجزیــه و تحلیــل آمــاری اولیــه بــا اســتفاده از آزمــون

( Kolmogrov Smirnov) K.S. مشخص کـرد کـه دادههـا دارای توزیع نرمال هستند. سپس با اسـتفاده از آنـالیز واریـانس (ANOVA) یک طرفه در محـیط نـرم افـزار آمـاری SPSS، معنی دار بودن اختلافات گروه های تحـت آزمـایش نسـبت بـه کنترل نشان داده شد. در ادامه به منظور بررسی اختلافات بـین گروه هـا، بـا تسـتهـای LSD)Post-hoc و(Tukey HSD محاسبات بیشتر انجـام شـد. اخـتلاف داده هـای (اعـداد) ثانیـه شصتم پس از تزریق دوزهای مختلف به دادههای ثانیه پنجم به

۱۲۳ ۳۲۱

صورت حسابی ( اختلاف تعداد) محاسبه و به صورت میانگین± خطای استاندارد نمایش داده شد. ضریب آلفـا =۰/۰۵ در نظـر گرفته شد. برای تجزیه و تحلیل کمی و کیفی داده های مربوط به تکنیک سیتوشیمیایی NADPH-d با استفاده از نـرم افـزار Image Tool از هر نمونه لام عکس برداری به عمـل آمـد، و عکــس هــا در محــیط ایــن نــرم افــزار تحــت کالیبراســیون در مساحت های ۱۰۰ میکرومتری مورد بررسی قرار گرفت.

یافته ها

بر اساس مشاهداترفتاریمربوط به زمان های مختلف ۰ ، ۵ ، ۱۵، ۳۰، ۶۰ ، ۱۲۰ و (Time interval)180، اختلاف تعداد سلول ها در ثانیه شصتم پس از تلقیح نسـبت بـه ثانیه پنجم مبنای پاسخ رفتاری سلول های P.caudatum بـه داروها در نظر گرفته شد (پنج ثانیه اول به عنوان زمان آشـنایی و سازگاری حیوانات در مواجهه با ماده تلقـیح شـده و برقـراری

گرادیان غلظت ماده مذکور در نظر گرفته شد).

پاسخ :Morphine شکل ۱ نشان دهنده پاسـخ مـرفین در

P.caudatum است. داده ها باآنالیز واریانس (ANOVA) یک طرفه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت که بـا توجـه بـه نتیجـه آزمون: (F(9,30) = 97.813, p<0.001) اختلافات گـروههـا با کنترلکاملاً معنیدار است. آنالیز بیشتر با آزمون های Posthoc نشان می دهد که مـرفین در دوز ۲g نسـبت بـه سـایر دوزها بیشترین افزایش را در تعداد سلولها دارد.

پاسخ ال- آرژینین :(L-Arginine) شکل ۲ نشان دهنـده تاثیر دوزهای مختلف ۱)L-arginine،۲،۴،۸ برحسـب(µg/µl به تنهائی بر سلولهـای P.caudatum در مقایسـه بـا کنتـرل است. اختلاف تعداد سلول هـا در ثانیـه شصـتم پـس از تلقـیح نسبت به ثانیه پنجم، تحـت ۴X از میکروسـکوپ نـوری بارهـا محاسبه و دادهها به صورت میانگین±خطای اسـتاندارد نمـایش داده شده اند. نتیجه آنالیز داده ها با آنالیز واریـانس یـک طرفـه (F(4,19)=140.699, p<0.001):(ANOVA) نشــــــان

شکل -۱نمودار دوز- پاسخ مرفین در حیوان تک یاخته ای است دوزهای مختلف مرفین۶۰)،۴۰،۲۰،۱۶،۸،۴،۲،۱،۰/۵برحسب(µg/µlمطابق دستورالعملمندرج در متن به حیوانات تجویز و در فواصل زمانی ۰ تا ۱۸۰ ثانیه رفتار آن ها به واسطه شمارش سلولی نسبت به کنترل که آب مقطر بود ثبت گردید. داده ها به صورت میانگین Mean±SEM اختلاف تعداد سلول های P. caudatum در ثانیه شصتم پس از تلقیح نسبت به ثانیه پنجم (مطابق با مندرجات بخش روش ها)، تحت ۴X از میکروسکوپ نوری ارائه شده است. با آنالیز Post hoc اختلافات نسبت به کنترل p<0.001 و p<0.01 و p<0.05 می باشد.

۲۲۳ ۳۲۲

شکل -۲پاسخ ال_آرژینین را به تنهائی در حیوان تک یاخته ای نشان می دهد. عامل۲)،۱،۸،۴برحسب(µg/µlمطابق دستورالعمل مندرج در متن به حیوانـات تجـویز و درفواصل زمانی ۰ تا ۱۸۰ ثانیه رفتار آن ها به واسطه شمارش سلولی نسبت به کنترل که آب مقطر بود ثبت گردید. داده ها به صورت میانگین Mean±SEM اختلاف تعداد سلول های P.caudatum در ثانیه شصتم پس از تلقیح نسبت به ثانیه پنجم (مطابق با مندرجات بخش روش ها)، تحت ۴X از میکروسکوپ نوری ارائه شـده اسـت . بـا آنـالیز Posthoc اختلافات نسبت به کنترل p<0.001 و p<0.05 می باشد.

شکل -۳پاسخL-NAMEرا به تنهائی در حیوان تک یاخته ای نشان می دهد. عامل۸)،۴،۲،۱برحسب(µg/µlمطابق دستورالعمل مندرج در متن به حیوانات تجویز و درفواصل زمانی ۰ تا ۱۸۰ ثانیه رفتار حیوانات به واسطه شمارش سلولی نسبت به کنترل (آب مقطر) ثبت گردید. داده ها به صورت میانگین Mean±SEM اختلاف تعداد سلول های P.caudatum در ثانیه شصتم پس از تلقیح نسبت نشان به ثانیه پنجم (مطابق با مندرجات بخش روش ها)، تحت ۴X از میکروسکوپ نوری ارائه شده است. با آنالیز Post hoc اختلافات نسبت به کنترل p<0.001 و p<0.05 داده شد.

می دهد که اختلاف گروه ها با کنترلکاملاً معنـیدار اسـت. از آنالیز های Post hoc مشـخص گردیـد کـه دوز ۲g L-arg نسبت به سایر دوزهـای L-arg بیشـترین افـزایش را در تعـداد سلول های P.caudatum به دنبال داشته است.

پاسخ :L-NAME شکل ۳ پاسخ L-NAME را به تنهائی نشــان مــی دهــد. دوزهــای مختلــف ۱)L-NAME،۲،۴،۸ برحسب(µg/µl به حیوانات تجویز و اختلاف تعداد سلول هـای P.caudatum درثانیه شصتم پـس از تلقـیح نسـبت بـه ثانیـه

پنجم، تحت ۴X از میکروسکوپ نـوری بارهـا محاسـبه شـد و میانگین داده ها ± انحراف معیار گزارش گردید. گـروه کنتـرل فقــط آب مقطــر را دریافــت کــرد. دادههــا بــا آنــالیز واریــانس (ANOVA) یک طرفه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت، که با توجــه بــه نتیجــه آزمــون: (F(4,19)=48.905, p<0.001) اختلاف گروه ها با کنترلکاملاً معنی دار می باشد. آنـالیز بیشـتر حاکی است که دوز ۲g L-NAME بیشترین کـاهش تعـداد سلول های P.caudatum را به دنبال داشته است.

۳۲۳ ۳۲۳

شکل -۴پاسخ ال_آرژینین را همراه با مرفین در حیوان تک یاخته ای نشان می دهد. عامل سیستم نیتریک اکساید(۴µg/µl)مطابق دستورالعمل مندرج در متن مقدم بردوز موثر مرفین (۲µg/µl) به حیوانات تجویز و در فواصل زمانی ۰ تا ۱۸۰ ثانیه رفتار آن ها به واسطه شمارش سلولی نسبت به کنترل که فقط مرفین (۲µg/µl) بود ثبت گردید. داده ها به صورت میانگین Mean±SEM اختلاف تعداد سلول های P.caudatum در ثانیه شصتم پس از تلقیح نسبت به ثانیه پنجم (مطابق با مندرجات بخش روش ها)، تحت ۴X از میکروسکوپ نوری ارائه شده است. با آنالیز Post hoc اختلافات نسبت به کنترل p<0.001 و p<0. 01 و p<0.05 می باشد.

شکل -۵پاسخL- NAMEرا همراه با ال-آرژینین و مرفین در حیوان تک یاخته ای نشان می دهد. عامل سیستم نیتریک اکساید(۱-۸µg/µl)مطابق دستورالعمل مندرجدر متن مقدم بر دوز موثر ال-آرژینین (۴µg/µl) و این عامل اخیر مقدم بر مرفین (۲µg/µl) به حیوانات تجویز و در فواصل زمانی ۰ تا ۱۸۰ ثانیه رفتار آن ها به واسطه شمارش سلولی نسبت به کنترل که فقط مرفین (۲µg/µl) بود ثبت گردید. داده ها به صورت میانگین Mean±SEM اختلاف تعداد سلول های P.caudatum در ثانیه شصتم پس از تلقیح نسبت به ثانیه پنجم (مطابق با مندرجات بخش روش ها)، تحت ۴X از میکروسکوپ نوری ارائه شده است. با آنالیز Post hoc اختلافات نسبت به کنترل مثبت p<0.001 و p<0.01 می باشد.

پاسـخ مشـترک مـرفین و ال- آرژینـین (L-arg+2g کردند. داده ها حاصل تکرار مکرر آزمایش و محاسبه میانگین ±
:Morphine) شکل ۴ پاسخ مشترک مرفین و ال- آرژینـین را انحراف معیار است. آنالیز واریـانس (ANOVA) ایـن داده هـا
نشان می دهد. محور افقی نشـان دهنـده دوزهـای مختلـف-L اختلاف کاملاً معنیدار را نشان می دهد: ( F(4,15)=76.786,
۱)arg+2g Morphine،۲،۴،۸ برحسب(µg/µl میباشد کـه (p<0.001 میباشد. آنالیز بیشتر حاکی اسـت کـه دوز-۴g L
نسبت به کنترل مورد مقایسه قـرار گرفتنـد. کنتـرل مـذکور را arg (نسبت بـه سـایر دوزهـای (L-Arg بـه همـراه دوز ۲g
نمونه هائی تشکیل دادند که تنها دوز مـوثر مـرفین را دریافـت Morphine بیشــترین افــزایش را در تعــداد ســلول هــای

۴۲۳ ۳۲۴

شکل -۶پاسخ ال-آرژینین و یا پاسخ ترکیبی ال-آرژینین وL-NAMEرا همراه با مرفین در حیوان تک یاخته ای نشان می دهد. عامل پـیش سـاز (ال-آرژینـین )(۴µg/µl)یا به تنهائی مقدم بر دوز موثر مرفین (۲µg/µl) تچویز شد و یا مهار کننده سیستم نیتریک اکساید (۱-۸µg/µl) مطابق دسـتورالعمل منـدرج در مـتن م قـدم بـر دوز مـوثر ال – آرژینین (۴µg/µl) و این عامل اخیر مقدم بر مرفین (۲µg/µl) به حیوانات تجویز و در فواصل زمانی ۰ تا ۱۸۰ ثانیه رفتار آن ها به واسطه شمارش سلولی نسبت به کنترل هـای منفی (فقط آب مقطر) و مثبت (مرفین (۲µg/µl ثبت گردید. داده ها به صورت میانگین Mean±SEM اختلاف تعداد سلول های P.caudatum در ثانیه شصتم پس از تلقـیح نسبت به ثانیه پنجم (مطابق با مندرجات بخش روش ها)، تحت ۴X از میکروسکوپ نوری ارائه شده است. با آنالیزPost hoc اختلافات نسبت به کنترل مثبـت p<0.001

و p<0. 01 و p<0.05 می باشد.

P.caudatum به دنبال داشته است. عامل مهار کننده آنزیم مولد نیتریک اکساید و پـیش سـاز ایـن
پاسـخ مشـترک :L-NAME+L-Arginine+Morphine مولکول (نیتریک اکساید) در حیوانات در شـکل ۶ نمـایش داده
شکل ۵ این پاسخ را نشان می دهد. محور افقی نشـان دهنـده شده است. همانگونه که این تصویر نشان می دهد با مهار آنزیم
دوزهای مختلف ۱)L- NAME،۲،۴،۸ برحسب(µg/µl اسـت اثرات تقویتی متوقف شد کـه ایـن امـر بـر مشـارکت نیتریـک
که مقدم بر ۴g L- arg و آن مقـدم بـر ۲g Morphine اکساید در پاسخ تقویت شده دلالت دارد.
تجویز شد. پس از محاسبه داده ها مطابق قسـمت هـای دیگـر پاســــــخ مشــــــترک مــــــرفین و نالوکســــــون:
داده ها با آنالیز واریانس (ANOVA) یک طرفه مورد تجزیـه و :(Naloxone+Morphine) شــکل ۷ ایــن پاســخ را نشــان
تحلیـــل قرارگرفت،کـــه بـــا توجـــه بـــه نتیجـــه آزمـــون: می دهد. محور افقی نشان دهنده آن است که دوزهای مختلف
(F(4,19)=1.037, p<0.001) اختلاف گروهها با کنتـرل کـه ۰/۴)Naloxone، ۰/۲، ۰/۱، برحسب (µg/µl مقـدم بـر دوز
منهای L-NAME استکاملاً معنیدار میباشد. در دوز ۴g موثر مرفین ۲µg/µl تجـویز شـده اسـت و داده هـا بـا آنـالیز
L- NAME نسبت به سایر دوزها بیشـترین کـاهش در تعـداد واریانس (ANOVA) یک طرفه مـورد تجزیـه و تحلیـل قـرار
سلول های P.caudatum رخ داده اسـت. بـه منظـور مقایسـه گرفت، که با توجـه بـه نتیجـه آزمـون ( F(4,19)=400.856,
اثرات تقویتی ال-آرژینین بر پاسخ مرفین و اینکه این اثرات بـه (p<0.001 اختلاف گروهها با کنترل کاملاً معنی دار مـی باشـد .
واسطه نیتریک اکساید و نه ال-آرژینـین اسـت پاسـخ ترکیبـی نمونه کنترل را مرفین ۲µg/µl تشکیل می دهد. آزمون هـای

۵۲۳ ۳۲۵

فیزیولوژی و فارماکولوژی جلد ۱۵، شماره ۳، پاییز

شکل -۷پاسخ نالوکسون را همراه با مرفین در حیوان تک یاخته ای نشان می دهد. عامل رقابتی(۰/۱-۰/۴µg/µl)مطابق دستورالعمل مندرج در متن مقدم بر دوز موثرمرفین (۲µg/µl) به حیوانات تجویز و در فواصل زمانی ۰ تا ۱۸۰ ثانیه رفتار آن ها به واسطه شمارش سلولی نسبت به کنترل که فقط مرفین (۲µg/µl) بود ثبت گردید. داده ها به صورت میانگین Mean±SEM اختلاف تعداد سلول های P.caudatum در ثانیه شصتم پس از تلقیح نسبت به ثانیه پنجم (مطابق با مندرجات بخش روش ها)، تحت ۴X از میکروسکوپ نوری ارائه شده است. با آنالیز Post hoc اختلافات نسبت به کنترل مثبت p<0.001 می باشد.

High reaction to NADPH-d

No reaction to NADPH-d

Low reaction to NADPH -d

C8 8A 8B

شکل -۸این شکل شواهد سیتولوژیک را با استفاده از روش سیتوشیمیاییNADPH-diaphoraseبرای نشان دادن فعالیت سیسـتمNOدر سـلول هـا یP.caudatumنشان می دهد. با این روش تحت شرایط مختلف: :A دوز موثر مرفین به تنهائی :B دوز موثر مـرفین همـراه بـ ا ال-آرژینـین و :C دوز مـوثر مـرفین همـراه ال -آرژینـین و L-NAME، میزان و شدت رنگ آبی تولید شده که شاخصی از میزان فعالیت سیستم )NO فعالیـت آنـزیم (NOS مـی باشـد، تغییـر کـرده اسـت . پیکـان هـا موقعیـت واکـنش NADPH-diaphorase را نشان می دهند.

بیشتر مشخص کرد که اثر مهاری Naloxone بر قدرت مرفین (Morphine Potency) با افزایش غلظت (دوز) بیشتر میشود.

علاوه بر شواهد رفتاری بـا اسـتفاده از روش سیتوشـیمیایی NADPH-diaphorase (مندرج در قسمت مـواد و روش هـا)

فعالیت سیستم NO در سلول هـای P.caudatum نشـان داده شد. شواهد به دست آمده با این روش سیتوشـیمیایی مشـخص کننده آن است که تحت شرایط مختلف میـزان و شـدت رنـگ آبی تولید شده، شاخصی از میزان فعالیت سیستم )NO فعالیت

۶۲۳ ۳۲۶

تاثیر NO بر قدرت مرفین در Paramecium caudatum

آنزیم (NOS بوده و با نمونه شاهد تفاوت داشته اسـت، کـه بـا آنالیز داده ها تغییر فعالیت آنزیم NOS نشـان داده شـده اسـت (شکل .(۸

بحث

مرفین سلول هـای P.caudatum را مجتمـع کـرد و ال-آرژینین بر این پاسخ، تاثیر مثبت و تقویتی نشان داد، در مقابـل شدت پاسخ در این جانوران بـا پـیش تجـویز Naloxone (بـه عنوان مهارگر سیستم اپیوئیدی [۷] و L-NAME (بـه عنـوان مهارگر سیستم [۶] NO کاهش یافت، همچنین ایـن جـانوران در حالت کنترل (بدون تلقیح هر گونه ماده ای) نیز تجمـع کـم تری از خود نشان دادند، که این مساله میتواند به علـت حفـظ تعادل دمایی بدن جانور باشد. چرا که این جانوران تـک یاختـه ای برای تنظیم گرمای بدن خود، سعی در تجمع در یک نقطـه را دارند [۱۴]، و اما در پاسخ مرفین، می توان بـه طـور کلـی در سطح رفتاری و فارماکولوژیک نتیجـه گرفـت کـه سـلول هـای P.caudatum نسبت به دوزهای مختلـف مـرفین پاسـخهـای متفاوتی از خود نشان مـیدهنـد، بـه طـوری کـه در دوز ۲g مرفین حداکثر قدرت مرفین (Morphine potency) در ایجـاد تجمع سلول های P.caudatum رخ داده است، در حالی که در دوزهــای بــالاتر مــرفین ۸) و ۱۶ و ۲۰ و ۴۰ و ۶۰ میکروگــرم) پاســخ منفــی اســت، و کــاهش شــدید تعــداد ســلولهــای P.caudatum و در نتیجه کاهش قدرت مرفین ( Morphine(potency مشاهده می شود. این امر نشان دهنده پاسخ وابسته بــه دوز بــوده و بــروز تعــدادی از اثــرات جــانبی را توســط دارو منعکس می کند .[۲۱] این یافته درسطح ملکولی بـه طـورکلی بیانگر وجود سیستم سیگنالینگ مرفین (رسپتورها و ملکول های سـیگنالینگ) در ســلولهـای P.caudatum مــیباشـد کــه در توضیح پاسخ Naloxoneذیلاً در مورد آن بیشتر بحث خواهـد شد. و اما در توجیح پاسخ ال-آرژینین یافته ها در سطح رفتـاری بیانگر این است که سلول های P.caudatum نسـبت بـه ال-آرژینین پاسخ مثبتی از خود نشان می دهند یعنی ال-آرژینین به عنوان یکی از اجزای اصلی سیستم نیتریک اکساید [۸]، با تولید NO در درون ســلول مــیتوانــد عامــل جــذب ســلول هــای P.caudatum در نقطه تلقیح باشد، و اما در سطح ملکولی این

شاهرخی و همکاران ۱۳۹۰

یافته می تواند بیانگر ایـن امـر باشـد کـه وجـود سیسـتم NO درسلول های P.caudatum بسیار محتمل است. در تائیـد ایـن احتمال می توان به پاسخ منفـی ایـن سـلول هـا بـه مـاده L-NAME اشاره کرد که L-NAME بـه عنـوان یکـی از مهـار کننده های اصلی سیستم [۶] NO با مهار این سیستم در درون سلول می تواند عامل دفع P. caudatum در نقطه تلقیح باشد. در تلقیح مشترک مرفین با هـر یـک از مـواد-L-arginine ,LNAME وNaloxone، همانگونه که در بخش نتایج ذکر شـد، می توان به نکات جالبی اشاره کـرد، بـه طـور مثـال در تلقـیح مشترک مرفین و ال-آرژینـین، یافتـه هـا در سـطح رفتـاری و فارماکولوژیک بیانگر تأثیر مثبـت و قابـل توجـه ال-آرژینینـدر افزایش قدرت مـرفین (Morphine Potency) مـیباشـد، بـه طوریکه پاسـخ ایجـاد شـده در دوز مـؤثر ۴g L-arg+2gMorphine بســـیار بیشـــتر از دوز مـــؤثر مـــرفین (۲gMorphine) به تنهایی (حالت کنترل) میباشد، و اما در سـطح ملکولی با توجه به تأثیر ال-آرژینین (به عنوان یکـی از اجـزای اصلی سیستم (NO در تولید NO نتیجه مـی شـود کـه وجـود سیســتم NO در ســلول هــای P.caudatum بســیار محتمــل می باشددر. ضمن احتمالاً سیستم سیگنالینگ NO در تـداخل مثبت با مرفین (Morphine Potency) است، چرا که به دنبال تأثیر ال-آرژینین و تولید NO، قـدرت مـرفین در ایجـاد پاسـخ مثبت توسط سلول های P.caudatum بسیار بیشـتر از قـدرت مرفین بـدون تزریـق ال-آرژینـین (حالـت کنتـرل) مـیباشـد . همچنین در تلقیح مشترک مرفین، ال-آرژینـین و L-NAME یافته ها دال بر تائید مباحث فوق می باشـد، ایـن یافتـه هـا در سطح رفتاری و فارماکولوژیک بیانگر تأثیر مهـاری L-NAME بــر سیســتم NO و بــه دنبــال آن کــاهش قــدرت مــرفین (Morphine Potency) میباشد، به طوریکـه در دوز مـؤثر ۴g L-NAME + 4g L-arg + 2g Morphine نسـبت بـه حالـت کنتـرل (۴g L-arg +2g Morphine) پاسـخ جادای شده شدیداً کاهش یافته است. اما درسطح ملکولی، تأکید مجددی بر وجود سیستم NO و تداخل مثبت ایـن سیسـتم بـا مــرفین مــیباشــد و در نهایــت، پاســخ منفــی ســلول هــای P.caudatum به Naloxone می تواند در بر دارنده اطلاعات بیشتری در مورد وجود رسپتورهای اپیوئیـدی در ایـن جـانوران تک یاخته ای باشد.

۷۲۳ ۳۲۷

فیزیولوژی و فارماکولوژی

با توجه به اینکه Naloxone به عنوان آنتاگونیست رقـابتی (در برابر مرفین) برای تصاحب رسـپتور µ عمـل مـیکنـد [۷]، وجود رسپتور در P.caudatum بسیار محتمـل مـی شـود. از طرف دیگر میتوان فرض کرد که قدرت مرفین ( Morphine(Potency با عملکرد رسپتور رابطـه تنگاتنـگ و مسـتقیمی دارد .[۲۱] احتمالا” دوزهای ۰/۵ و ۱ میکروگرم مرفین (نمودار دوز- پاسخ مرفین)، کاهش در تعداد سلول های P.caudatum را به واسطه کافی نبودن غلظت (دوز) مرفین بـرای تحریـک و فعال کردن رسپتورهای اپیوییدی نشـان دادنـد، کـه البتـه ایـن مشکل غلظت (دوز) برای فعال کردن رسپتور دردوزهای ۲ و ۴ میکروگرم مرفین مرتفع شـده اسـت، بـه طوریکـه بیشـترین افزایش قدرت مرفین در دوز ۲g مرفین قابل مشاهده است. و اما در دوزهای ۸ و۱۶و۲۰و۴۰و۶۰ میکروگرم مـرفین مـی تـوان علت کـاهش در تعـداد سـلول هـای P.caudatum (کـاهش قدرت مرفین) نسبت به سایر دوزهـای مـرفین را در رابطـه بـا تداخل عمـل رسـپتورهای اپیوئیـدی µ) و و ( بـا یکـدیگر توجیه کرد ۲۱]، [چراکه احتمالاً درغلظت های (دوزهای) بـالای مرفین، علاوه بـر رسـپتور µ، رسـپتورهای دیگـر ) و ( نیـز تحریک و فعال می شوند، ولی از آنجاییکه سـیگنالینگی کـه در اثر فعالیت یک رسپتور به راه می افتد، ممکن است سـیگنالینگ رسپتور دیگر را مهار کند .[۲۱,۲] میتوان چنین در نظر گرفت که اولاً رسپتور µ تحریـک پـذیرتر از رسـپتورهای و مـی باشد، که این مساله می تواند توجیه کننده حالتتقریباً سینوسی نمودار دوز- پاسخ مرفین (شکل (۱ باشد. دیگر اینکـه عملکـرد رسپتورهای و مانع اعمال اثر رسپتور میشود و در نتیجه کــاهش قــدرت مــرفین (Morphine Potency) در دوزهــای

بالای مرفین ۸)و۱۶و۲۰و۴۰و۶۰ میکروگرم) اتفاق می افتد.