یزد دانلود |
دانلود فایل علمی فایل ورد کامل مقاله علمی درباره تهیه کریستال لوسیفراز جهشیافته از گونه Lampyris turkestanicus و بررسی مقدماتی الگوهای پراش حاصل
در حال بارگذاری
توجه : به همراه فایل word این محصول فایل پاورپوینت (PowerPoint) و اسلاید های آن به صورت هدیه ارائه خواهد شد
فایل ورد کامل مقاله علمی درباره تهیه کریستال لوسیفراز جهشیافته از گونه Lampyris turkestanicus و بررسی مقدماتی الگوهای پراش حاصل دارای ۱۶ صفحه می باشد و دارای تنظیمات در microsoft word می باشد و آماده پرینت یا چاپ است
فایل ورد فایل ورد کامل مقاله علمی درباره تهیه کریستال لوسیفراز جهشیافته از گونه Lampyris turkestanicus و بررسی مقدماتی الگوهای پراش حاصل کاملا فرمت بندی و تنظیم شده در استاندارد دانشگاه و مراکز دولتی می باشد.
توجه : در صورت مشاهده بهم ریختگی احتمالی در متون زیر ،دلیل ان کپی کردن این مطالب از داخل فایل ورد می باشد و در فایل اصلی فایل ورد کامل مقاله علمی درباره تهیه کریستال لوسیفراز جهشیافته از گونه Lampyris turkestanicus و بررسی مقدماتی الگوهای پراش حاصل،به هیچ وجه بهم ریختگی وجود ندارد
بخشی از متن فایل ورد کامل مقاله علمی درباره تهیه کریستال لوسیفراز جهشیافته از گونه Lampyris turkestanicus و بررسی مقدماتی الگوهای پراش حاصل :
مقدمه
موجودات بیولومینسانت در سرتاسر محیطهای خشکی و آبی پراکندهاند و شامل باکتریها، حشرات، کیسهتنان، مرجانهای آبی و غیره میشوند .(۱۹) حشرههای شبتاب یکی از صدها گونه جانوری میباشند که در دل تاریکی جنگلها میدرخشند. آنها از پرتوهای نور ساطع شده به منظور فرستادن علائم تولید مثلی، دفاع و; به یکدیگر استفاده میکنند. گونههای متنوعی از حشرههای شبتاب و کلاً موجودات تولید کننده نور در طبیعت وجود دارند، اما آنچه این تکثر را به وحدت تبدیل میکند، وجود یک خانواده پروتئینی مشابه در تمامی آنهاست که مسئول انتشار
نور میباشد و همچنین بسته به گونه منتشر کننده نور، نورهایی با رنگهای متفاوت و متنوع از موجودات منتشر کننده ساطع میشود .(۳۸) این خانواده پروتئینی لوسیفراز نامیده میشود. لوسیفرازها آنزیمهایی هستند که برای انتشار نور از سوبسترایی به نام لوسیفرین همراه با ATP وMg2+
و اکسیژن مولکولی برای نشر نورهایی با رنگهای متنوع استفاده میکنند (شکل-.(۱
آنزیم لوسیفراز، دومرحله آنزیمی آدنیلاسیون -D لوسیفرین و اکسیژناسیون لوسیفریل- آدنیلات – Luciferyl-) (adenylate را کاتالیز میکند .(۳۴)
۱۷۴
مجله پژوهشهای سلولی و ملکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۶، شماره ۲، ۱۳۹۲
-۱ لوسیفراز با آدنیلاسیون گروه کربوکسیل لوسیفرین در حضور Mg2+ ATP باعث فعال شدن این سوبسترا میشود.
– ۲ لوسیفراز همانند یک اکسیژناز (Oxygenase) عمل کرده و با اثر بر روی لوسیفریل- آدنیلات، ضمن تولید محصولات، ایجاد پرتو نوری میکند.
میزان آنزیمهای لوسیفراز مولد نورهای غیر اختصاصی در محیط سلولی، به مقدار نانومولار با استفاده از لولههای تقویت کننده نوری (Photomutiplier tubes (PMTs) یا وسایل همراه با بار (Charge- coupled devices) تخمین زده میشوند(۵ و .(۳۷ این حساسیت بالای اندازهگیری سطح آنزیم، لوسیفرازها را به نمایندگانی شایسته برای کاربردهای گوناگون تبدیل کرده است که از جمله آنها عبارتند از: ردیابی مراحل رشد باکتریها در محیط، (۱۵)
برای ردیابی باکتریها و سمهای محیطی، ۶)، ۳۲ و (۳۵
سنجش میانکنشهای بیومولکولی بر پایه انتقال انرژی رزونانس بیولومینسانس، ۳)، ۲۸، ۴۰ و (۴۱ حسگرهای زیستی بر پایه- کل- سلول،( (Whole-cell-based 16) biosensors، ۱۷ و (۳۶ سنجشهای بیان ژن، ۱۴)، ۲۴
و (۲۷ ردیابی رشد تومورهای سرطانی و متاستاز، ۷)، ۲۹ و (۴۲ مطالعه جزئیات حمل و نقل سلولی، (۱۸-۳۴) مطالعه جزئیات تنظیمات ژنتیکی،((۸) (Cell traficking ترشح پروتئین درجایگاههای ویژه، ( (Protein site-specific (15) secretion آنالیز بیماریهای عفونی، (۲۲) تعیین توالی
DNA با استفاده از لوسیفراز حشرهی شبتاب به روش Pyrosequencing ، (۳۱) کاربرد بیولومینسانس در غربالگری داروها ( (Bioluminescence in drug (11-33) screening و کاربرد لوسیفراز در آزمونهای
ایمنی(.(۲۳) (Immuno assay
نکته قابل توجه اینکه، اغلب سنجشهای بیان ژن نیازمند دو گزارشگر لوسیفرازی با دو رنگ متفاوت منتشرکننده با یک سوبسترای مشترک میباشند(.(۵
شکل-۱ واکنش کاتالیز شده توسط لوسیفراز حشره شبتاب
بهدست آوردن تککریستال، اولین مرحله در آنالیز ساختاری یک پروتئین به کمک اشعه x میباشد. کریستال کردن پروتئینها اساساً روشی مبتنی بر سعی و خطا بوده که در آن پروتئین از حالت محلول به آهستگی رسوب میکند.
حضور ناخالصیها، هستههای کریستاله کننده و دیگر فاکتورهای ناشناخته، نقش مهمی در این فرایند بر عهده دارند.
طی چند دهه گذشته، لوسیفرازهای حشرات متفاوت شبتاب به طور گستردهای مطالعه شدهاند که در این میان بیشترین تحقیقات روی لوسیفراز نوع آمریکای شمالی با نام علمی Photinus pyralis انجام گرفته است. در شمال ایران (جنگلهای آمل(((۲ دو گونه حشره شبتاب با نام
Lampyris turkestanicus و Lamproidea maculata
مشاهده و گزارش شده است. گونه Lampyris
۱۷۵
مجله پژوهشهای سلولی و ملکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۶، شماره ۲، ۱۳۹۲
turkestancus به فراوانی یافت میشود در حالی که گونه L. maculata گونهای نادر با ویژگیهای ریختشناختی منحصر به فرد میباشد .(۱۳)
بسته به فاکتورهای متفاوت -که یکی از مهم ترین آنها اسیدآمینههای تشکیل دهنده لوسیفراز است- از لوسیفرازها نورهایی با طیف رنگی متفاوت منتشر میشود. حشره
شبتاب گونه ایرانی با نام علمی Lampyris
turkestanicus حاوی لوسیفرازی است که پرتویی به رنگ سبز منتشر میکند(.(۲ این گونه در جنگلهای شمال ایران
(آمل) زندگی میکند. در این کار برای اولین بار کریستال
لوسیفراز جهش یافته گونه ایرانی Lampyris
turkestanicus -که نور قرمز ساطع میکند- تهیه شد(.(۱
مکانیسمهای متفاوتی جهت توجیه تغییر رنگ نور انتشار یافته از لوسیفرازها بیان شدهاند که براساس جدیدترین و آخرین نظریه این تغییر، در نتیجه دو فاکتور اصلی است و تنها به تک حالت تهییج شده شکل کتویی آنیون فنولات اکسی لوسیفرین وابسته است.
این دو فاکتور عبارتند از:
-۱ قطبیت محیط جایگاه فعال لوسیفراز حول آنیون اکسی لوسیفرین
-۲ میانکنش میان اتم O8′ آنیون اکسی لوسیفرین حالت تهییج شده و اتم هیدروژن جفتکاتیون آن- شکل پروتونه ناحیه بازی آمینواسیدی در جایگاه فعال است- .(۲۱)
به منظور بررسی مکانیسم تغییر رنگ نور-که هنوز هم به صورت معمائی باقیمانده است- حاصل از لوسیفراز جهش افته با سایر لوسیفرازهای تعیین ساختار شده در مراحل بعدی کار، ساختار سهبعدی لوسیفراز با آنالیز پراش حاصل از کریستال تعیین گردید. (تلاشهای اولیه برای تهیه کریستال لوسیفراز گونه طبیعی در شرایط یکسان با لوسیفراز جهش یافته بدون نتیجه ماند.)
مواد و روشها
بیان، تخلیص و تعیین فعالیت و غلظت پروتئین: بیان
پروتئین “جهش یافته” در باکتری اشرشیاکلی گونه BL21
حاوی پلاسمید بیانی pET28a در محیط کشت TB -که حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین با غلظت۵۰ میلی گرم در هر میلیلیتر بود- به انجام رسید. به این منظور ابتدا باکتری برای مدت۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد با دور
“r.p. m” 250 انکوبه شد و سپس بیان پروتئین با افزایش
mM1 IPTG و ۴ میلی مولار لاکتوز القاء شد و باکتریها به مدت ۱۲ ساعت در دمای ۲۲ درجه سانتیگراد با دور ۲۰۰
“r.p.m” انکوبه شدند.
بعد از هر بار کشت و تست بیان پروتئین به وسیله دستگاه فلوریمتر، دیواره باکتریها پس از معلق سازی در بافر لیزکننده غشاء (شامل mM 10 هپس ، mM 300 نمک کلرید سدیم، mM 10 ایمیدازول، ۱۰ درصد گلیسرول در اسیدیته (۷/۸ و مقدار mM1 PMSF در سرما با استفاده از دستگاه FRENCH-PRESS در ۲ تکرار متوالی شکسته شد. بقایای باکتریها و اجزای نامحلول آنها با استفاده از سانتریفیوژ با دور”۱۲۰۰۰ “r.p.m به مدت ۲۰ دقیقه رسوب داده شد و به این ترتیب عصارهای که حاوی کل پروتئینها بود، بهدست آمد.
از آنجا که پروتئین دارای دم-هیستیدینی است تخلیص پروتئین “جهش یافته” تنها با یک مرحله به وسیله ستون نیکل سفارز ۵ میلیلیتری محصول شرکت کیاژن صورت گرفت. به منظور متعادل سازی ستون با بافر، شستوشوی ستون با ۵۰ میلیلیتر بافر لیزکننده به ازای هر یک لیتر محیط کشت -که حاوی ۱۰میلی مولار هپس، ۱۰ درصد گلیسرول، ۳۰۰ میلی مولار نمک کلرید سدیم و mM 10
ایمیدازول در اسیدیته ۷/۸ در اتاق سرد است- با سرعت ۵
صورت گرفت. عصاره باکتری حاوی پروتئین -که باز هم فعالیت آن قبل از تخلیص آزمایش شد- با سرعت ۲-۱ از ستون عبور داده شد. در مرحله بعدی از شیب متفاوتی از
۱۷۶
مجله پژوهشهای سلولی و ملکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۶، شماره ۲، ۱۳۹۲
محلولهای شستشو با غلظتهای متفاوت ایمیدازول به ترتیب استفاده گردید و در مرحله آخر محلول جداکننده پروتئین
از mM 60-40-30 در اسیدیته ۸ با سرعت ۴-۳ و به از ستون با غلظت mM 250 ایمیدازول با اسیدیته ۸ و
میزان حدود ۴۰-۳۵ میلیلیتر برای خالصسازی پروتئین سرعت ۳ از ستون عبور داده شد (شکل .(۲
شکل – ۲ ژل SDS-PAGE حاصل از تخلیص پروتئین لوسیفراز جهش یافته
شکل – ۳ مراحل رشد کریستال لوسیفراز که شامل (a) رسوب پروتئین، (b) تشکیل کریستالهای سوزنی و (c and d) در نهایت رشد کریستالها تا اندازه دلخواه میباشد.
۱۷۷
Infinite M200
مجله پژوهشهای سلولی و ملکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۶، شماره ۲، ۱۳۹۲
جدول-۱ بافرهای متفاوت امتحان شده به منظور تست میزان حلالیت و پایداری پروتئین
بافر نمک کلرید سوکروز گلیسرول پلی اتیلن pH
سدیم گلیکول
۱ تریس mM 10 mM 50 %1 %10 7/8
۲ تریس mM 10 mM 50 %10 7/8
۳ هپس mM10 mM 50 %1 %10 7/8
۴ هپس mM10 mM 50 %10 7/8
۵ هپس mM10 mM 100 %1 %10 6/8
۶ هپس mM10 mM 100 %10 6/8
۷ هپس mM10 mM 100 %1 %10 %25 6/8
۸ هپس mM10 mM 100 %1 %10 7
۱۰ میکرولیتر محلول حاوی پروتئین را -که شامل بافر
۱۰۰-۱۰ میکرولیتر هپسmM 10 همراه با mM 150-100
نمک کلرید سدیم و ۱۰ درصد گلیسرول و ۱ درصد سوکروز در اسیدیتههای متفاوت ۷/۸ و ۶/۸ و ۷ و ۱۰
میکرولیتر بود- را با محلول کمپلکس حاوی ۵ میلی مولار لوسیفرین، نمک کلرید منیزیم با غلظت mM 5 و ATP با غلظت mM2 در بافر تریس با اسیدیته ۷/۸ مخلوط کرده، بعد از گذشت حدود یک دقیقه برای تطابق محلولها با
دمای محیط، فعالیت پروتئین با دستگاه
(TECAN) ثبت گردید(.(۱
تعیین غلظت پروتئین: جذب نوری محلولهای متفاوت حاوی پروتئین را با استفاده از دستگاه اسپکتروسکوپی اشعه ماوراءبنفش در ۲۸۰ نانومتر اندازهگیری شد. برای محاسبه وزن مولکولی پروتئین، نیاز به “ضریب خاموشسازی” پروتئین است که این ضریب به صورت تئوری با استفاده از جعبه Pro Param در سایت Expasy
و تنها با وارد نمودن توالی پروتئین محاسبه گردید.
“ضریب خاموش سازی” لوسیفراز گونه ایرانی ۳۸ بود.
کریستالوگرافی اشعه X پروتئین: دیالیز و نگهداری
پروتئین: دیالیز محلول پروتئینِی حاوی mM 250
ایمیدازول حاصل از تخلیص، با استفاده از کیسه دیالیز شرکت سیگما در اتاق سرد و با غلظت پروتئینی حدود ۲ mg/ml به مدت۱۲ ساعت انجام گرفت. به ازای هر ml 1
محلول پروتئین، یک لیتر محلول بافر دیالیز (بافرهای متفاوت ذکر شده در جدول (۱ استفاده شد.
تست بافرهای متفاوت که غلظتهای بالای پروتئینی در
آنها دارای بالاترین پایداری باشد: یکی از مهمترین مراحل انجام کریستالوگرافی، تهیه بافری است که پروتئین در آن بافر، بالاترین پایداری را (به لحاظ عدم رسوب و محلول ماندن پروتئین فعال در مدت طولانی) در غلظتهای بالای مورد نیاز برای تشکیل کریستال داشته باشد. این نکته نیز قابل توجه میباشد که این افزایش پایداری باید با حفظ فعالیت آنزیم در طولانی مدت همراه باشد. برای تحقق این امر پروتئین در بافرهای متفاوتی حل گردید (جدول .(۱
کریستال کردن پروتئین: کریستالهای لوسیفراز جهش یافته با استفاده از روش “قطره نشسته” بهدست آمد. خوشهای از کریستالهای سوزنی در شرایط متفاوتی رشد کردند (شکل
(۳-۴، اما ضخیمترین و طویلترین کریستالها بعد از حدود یک هفته در دمای ۲۰ درجه سانتیگراد در تاریکی، در ۵۰۰ نانولیتر بافر، حاوی mg/ml 4 لوسیفراز، mM 10
۱۷۸
مجله پژوهشهای سلولی و ملکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۶، شماره ۲، ۱۳۹۲
سدیم- هپس، EDTA mM 1 ، ۱۰ درصد (V/V)
گلیسرول، ۱ در سوکروز، mM 100 نمک کلرید سدیم و ۵
DTT mM در اسیدیته ۷ با ۵۰۰ نانولیتر محلول رسوب دهنده، حاوی۴ درصد PEG8000 (w/v)، ۱۴ درصد اتیلن گلیکول، mM 100 سدیم- هپس در اسیدیته ۷/۵ تشکیل
شد (شکل .(۴
آماده سازی محلولهای “محافظ در برابر سرما”
(Cryoprotectant) برای حفظ کریستال در برابر صدمات
ناشی از اشعه : X یکی از مهمترین مراحل در کریستالوگرافی، تهیه و استفاده از محلول محافظتکننده کریستال در برابر آسیب ناشی از تابش اشعه X به منظور
افزایش طول عمر کریستال در حین تابش اشعه X
میباشد. معمولاً محلولهایی با تشابه بالا به شرایط محلول رسوب دهندهای که کریستال در اثر آن رشد کرده است، بهترین محلولها برای حفاظت پروتئین در برابر اشعه X و
حفظ پایداری کریستال هستند. در این آزمایش محلولهای زیر تهیه شده و به منظور اطمینان از مفید بودن آنها، کیفیت محلولها با استفاده از تولید کننده اشعه X آزمایشگاهی بررسی شد.
اشتراکگذاری:
- لینک دانلود فایل بلافاصله بعد از پرداخت وجه به نمایش در خواهد آمد.
- همچنین لینک دانلود به ایمیل شما ارسال خواهد شد به همین دلیل ایمیل خود را به دقت وارد نمایید.
- ممکن است ایمیل ارسالی به پوشه اسپم یا Bulk ایمیل شما ارسال شده باشد.
- در صورتی که به هر دلیلی موفق به دانلود فایل مورد نظر نشدید با ما تماس بگیرید.
